ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Pikeun Industri Kimia komponén kimiawi, Kakurangan SPECC1L ngabalukarkeun ngaronjat stabilitas sendi spliced ​​sarta ngurangan shedding sél crest neural kranial.

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Pikeun Industri Kimia

Liaocheng Sihe SS Bahan Co., Ltd.mangrupakeun produsén ngarah anu husus dina pipa seamless stainless steel, tabung annealed caang, seamless coiled tubing jsb.Pikeun ngagampangkeun para nasabah, kami ogé ngalas pipa sareng tabung.Liaocheng Sihe SS Bahan Co., Ltd.gaduh alat produksi sareng uji anu paling canggih.Urang sagemblengna bisa nyugemakeun sarat Anjeun.Numutkeun standar anu ketat pisan, tabung anu diproduksi ku urang salawasna gaduh kasabaran OD sareng WT anu leres.Kontrol kasabaran sacara ketat saluyu pikeun ngahasilkeun standar.Produk urang salawasna wareg jeung konsumén.Konsumén ngagaleuh produk kami nyiptakeun langkung seueur kauntungan.
a) OD (Diaméter Luar): 3.18mm nepi ka 101.6mm
b) WT (Kandel Tembok): 0.5mm nepi ka 20mm
c) Panjang: Numutkeun sarat customer urang
d) Standar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 jsb
e) Métode Prosés: ERW, EFW jsb

Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.
Sél crest neural kranial (CNCC) slough off tilep saraf émbrionik sarta migrasi ka arches pharyngeal, nu ngabentuk lolobana struktur midface.Disfungsi CNCC muterkeun hiji peran penting dina etiology of orofacial cleft, a malformasi bawaan umum.Mutasi SPECC1L Heterozygous geus kapanggih dina penderita clefts atypical jeung syndromic.Di dieu, urang ngalaporkeun ningkat pewarnaan komponén canonical adhesive junction (AJ), β-catenin sareng E-cadherin dina sél knockdown SPECC1L berbudaya, sareng mikrograf éléktron nunjukkeun difusi apical-basal AJ.Pikeun ngartos peran SPECC1L dina morfogenesis craniofacial, kami nyiptakeun modél beurit anu kakurangan Specc1l.Mutan homozigot nyaéta émbrionik bisa nepi ka tiwasna sarta némbongkeun impaired panutupanana tabung saraf sarta laminasi CNCC.Pewarnaan protein AJ ningkat dina lipatan saraf mutant.cacad AJ Ieu konsisten jeung cacad dina delamination CNCC, merlukeun AJ disolusi.Salaku tambahan, mutan Specc11 parantos ngirangan sinyal PI3K-AKT sareng ningkat apoptosis.In vitro, inhibisi hampang tina sinyal PI3K-AKT dina sél tipe liar cukup pikeun ngadorong parobahan AJ.Anu penting, parobahan AJ anu disababkeun ku knockdown SPECC1L tiasa dibalikkeun ku aktivasina jalur PI3K-AKT.Dihijikeun, data ieu nunjukkeun yén SPECC1L, salaku régulator novél sinyal PI3K-AKT sareng biologi AJ, diperyogikeun pikeun panutupanana tabung neural sareng stratifikasi CNCC.
Sél crest neural kranial (CNCCs) localize kana neuroectoderm dorsal sarta coplokkeun tina neuroepithelium tina tilep neural ngembang ngaliwatan prosés ngalibetkeun transisi épitél-mesenchymal (EMT)1,2,3.CNCC épitél prémigrasi ngaganggu simpang intersélular sarta jadi CNCCs mesenchymal migrasi nu ngeusian arches pharyngeal kahiji jeung kadua sarta ngabentuk lolobana kartilage craniofacial.Ku kituna, gén nu ngatur fungsi CNCC mindeng kaganggu dina etiology of anomali kongenital craniofacial kayaning clefts orofacial, paling ilahar mangaruhan 1/800 kalahiran di AS nyalira.Salah sahiji cacad bawaan8.
Delamination of CNCC coincides jeung panutupanana tina tube neural anterior antara 8.5 na 9.5 poé ngembangkeun émbrionik di mencit.Mutan tina sajumlah gén beurit orofacial cleft pakait ogé némbongkeun sababaraha bentuk cacad tube neural, kaasup Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, sarta Pdgfrα12.Nanging, prosés panutupanana tabung saraf sareng stratifikasi CNCC tiasa dianggap mandiri, sabab beurit mutan Splotch (Pax3) nunjukkeun cacad dina panutupanana tabung neural tanpa aya pangaruh kana stratifikasi CNCC atanapi migrasi 13,14.Modél beurit tambahan kalayan cacad dina dissection CNCC sareng panutupanana tabung saraf bakal ngabantosan ngagambar dasar molekular umum tina dua prosés ieu.
Isolasi CNCC tina sél neuroepitélial merlukeun disolusi sambungan napel (AJs), nu diwangun ku kompléx protéin ngandung, antara séjén, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, jeung α-aktinin pakait jeung filamén aktin 2 . Overexpression studi E-cadherin dina tilep neural némbongkeun réduksi atawa reureuh di delamination CNCC.Sabalikna, suprési E-cadherin nyababkeun stratifikasi awal15,16.Seueur faktor anu nyapih EMT salami stratifikasi CNCC nyaéta faktor transkripsi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) sareng protéin remodeling matriks ekstrasélular (ECM) sapertos matrix metalloproteinase (MMPs), tapi CNCCs mangrupikeun régulator AJ sitoskeletal langsung. teu acan terang.Jalur PI3K-AKT dipikanyaho antagonize tingkat E-cadherin, utamana tina panalungtikan kanker17.Panaliti anyar nunjukkeun yén leungitna sinyal PI3K-AKT dumasar PDGFα dina mencit ngabalukarkeun abnormalitas craniofacial, kalebet cleft palate sareng neural tube defects12.Tapi, hubungan antara jalur PI3K-AKT sareng stabilitas AJ kana stratifikasi CNCC henteu écés.
Urang saacanna ngaidentifikasi SPECC1L salaku gén mutant munggaran dina dua jalma kalawan cleft parna nu manjangan ti sungut nepi ka panon, katelah cleft serong (ObFC) atawa Tessier IV18 cleft.Mutasi SPECC1L parantos diidentifikasi dina dua kulawarga multigenerasi kalayan sindrom Opitz G / BBB dominan autosomal (OMIM #145410), dimana individu anu kapangaruhan nunjukkeun hyperdistance sareng cleft lip / palate19, sareng dina hiji kulawarga anu sindrom overdistance Tibi (OMIM #145420)20 .leuwih ti satengah kasus Opitz G / sindrom BBB nu X-numbu (OMIM # 300000) sarta disababkeun ku mutations dina gén MID1, nu encodes protéin 22 tina rorongkong sél microtubule-pakait.Urang hipotésis yén SPECC1L, ogé protéin pakait sareng mikrotubulus jeung sitoskeleton aktin, bisa nyapih signalling diperlukeun pikeun remodeling sitoskeleton aktin salila adhesion sél jeung migrasi 18.Ngaliwatan studi in vitro sareng in vivo, ayeuna urang ngajelaskeun SPECC1L salaku régulator novél stabilitas AJ ngaliwatan sinyal PI3K-AKT.Dina tingkat sélulér, kakurangan SPECC1L nyababkeun panurunan dina tingkat protéin pan-AKT sareng paningkatan dina dispersi apical-basal AJ, anu dileungitkeun ku aktivasina kimiawi jalur AKT.In vivo, émbrio anu kakurangan Specc11 nunjukkeun gangguan panutupanana tabung saraf sareng ngirangan dissection CNCC.Ku kituna, fungsi SPECC1L dina signalling dumasar-adhesion sél kacida diatur diperlukeun pikeun fungsi CNCC normal salila morphogenesis raray.
Pikeun nangtukeun peran SPECC1L dina tingkat sélulér, kami nganggo garis sél osteosarcoma stabil anu dijelaskeun saméméhna U2OS kakurangan dina SPECC1L18.Sél U2OS stabil ieu sareng SPECC1L (kd) knockdown ngagaduhan panurunan sedeng (60-70%) dina tingkat transkrip sareng protéin SPECC1L, sareng cacad dina migrasi sareng reorganisasi sitoskeleton aktin 18. Kontras, panurunan samentara parna dina SPECC1L geus ditémbongkeun ngakibatkeun defects mitosis 23 .Kana characterization salajengna, urang manggihan yén sél SPECC1L-kd stabil urang robah morfologi dina tingkat pisan luhur confluence (Gambar 1).Sél kontrol individu jeung sél kd dina confluence low kasampak sarupa (Gambar 1A, D).24 jam sanggeus fusi, sél kontrol nahan bentuk cuboidal maranéhanana (Gbr. 1B, E), bari SPECC1L-kd sél elongated (Gbr. 1C, F).Luasna parobihan dina bentuk sél ieu kawengku ku pencitraan hirup in vivo sél kontrol sareng sél kd (pilem 1).Pikeun nangtukeun peran SPECC1L dina sél confluent, urang mimiti nalungtik éksprési na.Kami mendakan yén tingkat protéin SPECC1L ningkat nalika fusi (Gambar 1G), sedengkeun tingkat transkrip SPECC1L henteu ningkat (Gambar 1H).Sajaba ti éta, salaku dénsitas sél ngaronjat, protéin SPECC1L akumulasi dina wates intercellular (Gbr. 2A-E), kalawan pola tumpang tindih jeung β-catenin nu patali mémbran (Gbr. 2A'-E').Dibikeun pakaitna SPECC1L sareng sitoskeleton aktin 18,23 kami hipotésis yén SPECC1L berinteraksi sareng sambungan napel dumasar-aktin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) sél manjang dina confluence tinggi (F) dibandingkeun jeung kontrol sél U2OS (AC).Ditémbongkeun di dieu tilu tina genep titik waktu (T1, T3, T6) nu urang dipilih pikeun kapadetan sél béda.(G) analisis Western blot némbongkeun yén protéin SPECC1L stabilized dina tingkat luhur confluence dibandingkeun jeung tingkat low of confluence dina sél kontrol.Western blot of SPECC1L nembongkeun ekspektasi pita 120 kDa sarta pita beurat molekul luhur, kamungkinan pos-translationally dirobah (*).Analisis Western blot ieu dipigawé dina kaayaan anu sarua pikeun low tur luhur confluence.Gambar anu nunjukkeun SPECC1L dina confluence lemah sareng luhur dicandak tina blot anu sami.Blot anu sami dipiceun sareng ditaliti deui sareng antibodi β-aktin.(H) Analisis RT-PCR kuantitatif henteu nunjukkeun parobahan anu signifikan dina tingkat transkrip SPECC1L.Bar kasalahan ngagambarkeun SEMs tina opat percobaan bebas.
(AE) Urang milih genep titik waktu (T1-T6) ngalambangkeun sauntuyan kapadetan sél pikeun normalize analisis bentuk sél jeung parobahan AJ dina sél U2OS kalawan SPECC1L knockdown (kd).Lima mimiti titik waktu ieu kaasup sél tunggal (T1), 50-70% fusi gugusan sél leutik (T2), fusi tanpa reshaping sél kd (T3), reshaping sél kd (T4), sarta parobahan 24 jam.dina wangun posterior sél kd (T5).Protéin SPECC1L utamana disebarkeun dina sitoplasma dina T1 (A), tapi akumulasi na dititénan dina wates intercellular dina titik waktu saterusna (B-E, panah).(FJ) β-catenin nembongkeun akumulasi sarupa dina wates intercellular pakait jeung kompléks AJ.(A'-E') SPECC1L sareng β-catenin nunjukkeun pewarnaan tumpang tindih dina wates sél dina dénsitas sél anu luhur (panah).(F'-J') Dina sél SPECC1L-kd, pewarnaan β-catenin némbongan normal dina dénsitas sél low (F'-H'), tapi ngalegaan salaku parobahan bentuk sél (I', J'; panah), nunjukkeun yén AJ geus robah.Bar = 10 µm.
Urang teras nyobian nangtukeun pangaruh kakurangan SPECC1L dina AJ.Urang ngagunakeun sababaraha spidol AJ-pakait, kaasup komponén canonical F-aktin, myosin IIb, β-catenin, sarta E-cadherin24,25,26,27.Serat stress aktin ngaronjat dina sél SPECC1L-kd sakumaha ditétélakeun saméméhna (Gbr. 3A,B) 18.Myosin IIb pakait sareng filamén aktin némbongkeun kanaékan sarupa dina SPECC1L-kd sél in vitro (Gbr. 3C,D).β-catenin AJ-pakait meungkeut cadherin dina mémbran sél, némbongkeun pola éksprési "sayang madu" normal dina cubocytes kontrol (Gbr. 3E, G).Narikna, dina gambar datar maké mikroskop confocal, β-catenin (Gbr. 3E, F) jeung E-cadherin (Gbr. 3G, H) staining dina mémbran sél sél SPECC1L-kakurangan confluent némbongkeun pola nonjol tina staining nambahan.Perluasan ieu AJ-pakait β-catenin staining dina sél kd ieu paling diucapkan di confluence, tapi mucunghul miheulaan parobahan bentuk sél (Gbr. 2F-J, F'-J').Pikeun nangtukeun sifat fisik ngawarnaan AJ ngalegaan ieu, urang nalungtik wates sél dina beungeut apical-basal sél SPECC1L-kd U2OS ku transmisi mikroskop éléktron (TEM) (Gambar 3I, J).Kontras jeung sél kontrol (Gbr. 3I), nu miboga wewengkon padet éléktron misah indicative of AJ (panah), sél kd (Gbr. 3J) némbongkeun badag, wewengkon contiguous dénsitas éléktron tinggi indicative of AJ sapanjang pesawat apicobasal..Sajaba ti éta, dina bagian transverse, urang niténan tilep mémbran sél éksténsif dina sél kd (Gbr. S1A, B), nu ngécéskeun pola nambahan β-catenin sarta pita staining E-cadherin (Gbr. 3F, H).Pikeun ngarojong peran SPECC1L di AJs, β-catenin ieu co-immunoprecipitated kalawan SPECC1L di lysates sél U2OS confluent (Gbr. 3K).Marengan immunostaining ngalegaan pikeun spidol AJ, analisa TEM konsisten sareng hipotesa urang yén kakurangan SPECC1L ningkatkeun dénsitas sareng varians apical-basal AJ.
(AH) Ngaronjat pewarnaan F-aktin dina sél kd dina jam 48 saatos fusi (T6; A, B).Ngarobah pewarnaan myosin IIb pakait sareng F-aktin (C, D).Pola lemes tina β-catenin sareng pewarnaan mémbran E-cadherin dina sél kontrol (E, G) ditingkatkeun dina sél SPECC1L-kd (F, H).Bar = 10 µm.(I-J) Mikrograf éléktron niténan simpang antarseluler apikal-basal.Sél kontrol némbongkeun wewengkon éléktron-padet béda nunjukkeun junctions caket (I, panah).Kontras, sakabéh simpang apical-basal dina SPECC1L-kd sél mucunghul éléktron padet (J, panah), nunjukkeun ngaronjat dénsitas sarta dispersi tina junctions napel.(K) β-catenin ieu co-immunoprecipitated kalawan SPECC1L dina lysates sél U2OS confluent.Gambar dicokot tina hiji titik ngawakilan salah sahiji opat percobaan bebas.
Pikeun ngartos peran SPECC1L dina morfogenesis craniofacial, kami nyiptakeun modél beurit anu kakurangan Specc1l nganggo dua garis sél bubu ES mandiri, DTM096 sareng RRH048 (BayGenomics, CA), anu ngagambarkeun transkrip intron 1 sareng Specc1l direbut dina 15 (Gbr. 1) .4A, gambar S2).Lokasi génomik sisipan vektor decoy ditangtukeun ku urutan génom sakabeh tur dikonfirmasi ku PCR (Gbr. S2).Kadua desain bubu gén ogé ngamungkinkeun fusi in-frame para wartawan Specc11-lacZ nalika ditangkep.Ku alatan éta, éksprési lacZ ditangtukeun ku pewarnaan X-gal dipaké salaku indikator ekspresi Specc11.Kadua alél nunjukkeun pola éksprési lacZ anu sami, kalayan perangkap gen DTM096 dina intron 1 nunjukkeun ekspresi anu langkung kuat tibatan RRH048 dina intron 15 (henteu ditémbongkeun).Sanajan kitu, Specc1l loba dikedalkeun, kalawan éksprési utamana kuat dina tilep neural di E8.5 (Gambar 4B), dina tube neural jeung prosés raray di E9.5 na E10.5 (Gambar 4C, D), sarta dina ngembangkeun anggota awak. dina e10.5 jeung panon (Gambar 4D).Urang saméméhna ngalaporkeun yén éksprési SPECC1L dina arch pharyngeal munggaran di E10.5 hadir dina épitél jeung mesenchyme18 kaayaan, konsisten jeung nasab CNCC.Pikeun nguji éksprési SPECC1L di CNCC, urang ngalaksanakeun E8.5 neural tilep (Gambar 4E-J) jeung bagian tangkorak E9.5 (Gambar 4K-).Dina E8.5, SPECC1L patri neural tilep intensely (Gbr. 4E, H), kaasup sél patri ku spidol NCC (Gbr. 4G, J).Dina E9.5, SPECC1L (Gbr. 4K, N) niatna patri Migrasi CNCC co-patri kalawan AP2A (Gbr. 4L, M) atanapi SOX10 (Gbr. 4O, P).
(A) Répréséntasi skéma tina gén Specc11 beurit nunjukkeun sisipan vektor decoy dina ES DTM096 (intron 1) sareng RRH048 (intron 15) klon sél.(BD) lacZ staining of heterozygous Specc1lDTM096 émbrio ngagambarkeun éksprési Specc1l ti E8.5 mun E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = lengkung pharyngeal munggaran.(EP) SPECC1L immunostaining kalawan NCC spidol AP2A na SOX10 di E8.5 (NF; EJ) tilep neural jeung E9.5 (KP) bagian tangkorak.SPECC1L staining ieu loba observasi dina neural tilep E8.5 (E, H; panah), kaasup sél dilabélan AP2A (F, G; panah) jeung SOX10 (I, J; panah).Dina E9.5, SPECC1L kuat patri migrasi CNCCs (K, N; panah) dilabélan AP2A (L, M; panah) jeung SOX10 (O, P; panah).
Nyebrang antara beurit Specc1lDTM096/+ jeung Specc1lRRH048/+ hétérozigot nunjukeun yén dua alél perangkap gén henteu saling melengkapi sarta yén sanyawa hétérozigot jeung homozigot émbrionik pikeun boh alél bubu gen téh bisa nepi ka tiwasna émbrionik (Tabel S1).Babandingan Mendelian nunjukkeun panurunan dina tingkat survival heterozigot nalika lahir (diperkirakeun 1.34 vs 2.0).Urang nyatet mortality perinatal low diantara heterozygotes, sababaraha miboga anomali craniofacial (Gbr. S3).Sanajan kitu, penetrasi low tina phenotypes craniofacial perinatal ieu ngajadikeun hésé diajar mékanisme patofisiologis maranéhanana.Ku alatan éta, urang museurkeun kana fénotip maot émbrionik tina mutan Specc11 homozigot.
Paling sanyawa heterozygous atanapi homozygous Specc1lDTM096 / RRH048 émbrio mutant teu ngamekarkeun sanggeus E9.5-10.5 (Gbr. 5A-D), sarta tube neural henteu nutup anteriorly (Gbr. 5B, D) sarta kadangkala ditutup posteriorly (teu ditémbongkeun). ..Cacat panutupanana tabung neural kranial ieu pakait sareng mayoritas CNCC ditandaan DLX2 sésana dina tilep neural di E10.5, nunjukkeun euweuh dissection (Gambar 5A'-D').Pikeun nangtukeun naha ukuran sakabéh CNCC ogé ngurangan, kami tagged garis CNCC kalawan GFP dina garis bubu gén urang kalawan Wnt1-Cre na ROSAmTmG.Urang ngalirkeun data diurutkeun GFP + NCC na GFP- (RFP +) non-NCC ti sakabeh embryos.Dina E9.5, proporsi aliran-diurutkeun GFP-dilabélan CNCCs teu robah nyata antara WT na embrio mutant (teu ditémbongkeun), nunjukkeun spésifikasi CNCC normal.Kituna, urang hipotésis yén residual Wnt1-Cre na DLX2 staining dina tilep neural kakeunaan (Gambar 5B ') éta alatan layering CNCC cacad, jigana alatan ngaronjat dénsitas atawa dispersi sél AJ, sakumaha katingal dina SPECC1L-kd sél.Kami nganggo spidol NCC SOX10, AP2A, sareng DLX2 pikeun mastikeun ayana CNCC dina lipatan saraf (Gambar 5E-R).Dina E8.5, neural melu staining pikeun sakabéh tilu spidol NCC ieu observasi dina bagian tina WT (Gbr. 5E, G, I) jeung Specc1l mutant (Gbr. 5F, H, J).Dina E9.5, bari spidol NCC patri Migrasi NCC dina bagian WT (Gbr. 5M, O, Q), residual NCC staining ieu observasi dina tilep neural kakeunaan of Specc1l embrio mutant (Gbr. 5N, P, Urang Sunda).Kusabab SOX10 sareng DLX2 nandaan migrasi CNCCs, hasil ieu nunjukkeun yén SPECC1L-kakurangan CNCC ngahontal spésifikasi pasca-migrasi tapi gagal migrasi tina lipatan saraf.
Kakurangan Specc11 ngabalukarkeun panutupanana tabung saraf cacad, delaminasi sél crest neural kranial sareng AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Émbrio nu mawa sél crest neural kranial migrasi (CNCC) dilabélan ku Wnt1-Cre (A').Sabalikna, émbrio mutant Specc11 nunjukkeun lipatan saraf kabuka (B), panah) sareng CNCC anu henteu migrasi (B', panah).(C, D ') Gambar widang caang (C, D ') jeung immunostaining (C', D') tina CNCC spidol DLX2 of E10.5 WT embrio (C, C ') sarta Specc1l (D, D').Dina émbrio WT E10.5, DLX2-positip CNCC ngajajah arches insang (C', panah), sedengkeun dina mutan, pewarnaan conspicuous persists dina lipatan saraf kabuka (D', panah) jeung dina arches pharyngeal munggaran (D', panah).) kalawan sababaraha staining (panah) nunjukkeun delamination goréng jeung migrasi CNCC.ER) Bagéan émbrio mutan WT sareng Specc1l dina tahap E8.5 (E–L) sareng E9.5 (M–R) dilabélan ku spidol NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) jeung DLX2 (I, J, Q, R).Dina E8.5, pewarnaan NCC dititénan dina lipatan saraf tipe liar (NF) sareng bagian mutant.Co-staining of SOX10 na β-catenin dina E8.5 WT (K) jeung mutant (L) wangsit ngaronjat β-catenin staining dina wates sél dina tilep neural.Dina E9.5, ngawarnaan liar-tipe tina migrasi CNCCs (M, O, Q) dititénan, sedengkeun dina mutan, CNCCs unstratified patri tilep neural kabuka (N, P, R).(S–Z) Analisis labél in vivo AJ dina bagian koronal WT sareng Specc11DTM096/RRH048 émbrio kalayan mutasi E9.5.Hiji perkiraan plane sectional ditémbongkeun di pojok katuhu luhur.Dina bagian jaringan mutan, paningkatan pewarnaan F-aktin (S, T) sareng myosin IIb (U, V) ditingali.Sarupa jeung hasil in vitro dina Gbr. 3, dina embryos mutant, ningkat mémbran staining pikeun β-catenin (W, X) jeung E-cadherin (Y, Z) ieu observasi.(AA-BB) Mikrograf éléktron bagian tina émbrio tipe liar ningali saluareun wates sél apical-basal némbongkeun wewengkon éléktron-padet béda nunjukkeun junctions napel (AA, panah).Sabalikna, dina bagian tina émbrio mutant Specc11 (BB, panah), sakabéh simpang apicobasal padet éléktron, nunjukkeun ngaronjat dénsitas sarta dispersi tina junctions napel.
Pikeun nguji hipotésis urang yén ngurangan layering alatan AJ dirobah, urang nalungtik AJ panyiri dina tilep neural kakeunaan tina Specc1l embrio mutant (Gbr. 5S-Z).Urang observasi kanaékan serat stress aktin (Gbr. 5S, T) sarta concomitant ngaronjat lokalisasi of myosin IIB staining on serat aktin (Gbr. 5U, V).Importantly, urang observasi ngaronjat staining of β-catenin (Gbr. 5W, X) jeung E-cadherin (Gbr. 5Y, Z) dina wates intercellular.Urang ogé nalungtik β-catenin staining of NCC dina tilep neural of E8.5 embryos (Gbr. 5K, L).Pewarnaan β-catenin katingalina langkung kuat dina tilep saraf mutant Specc1l (Gbr. 5L sareng K), nunjukkeun yén parobahan AJ parantos dimimitian.Dina micrographs éléktron bagian tangkorak E9.5 embryos, urang deui observasi ngaronjat diffuse éléktron-padet staining di Specc1l embrio mutant dibandingkeun WT (Gbr. 5AA, BB na S1E-H).Dihijikeun, hasil ieu ngadukung hasil in vitro kami dina sél SPECC1L-kd U2OS sareng nunjukkeun yén ngawarnaan AJ anu nyimpang sateuacan stratifikasi CNCC dina émbrio mutant urang.
Dibikeun hubungan antagonis anu dipikanyaho antara kagiatan AKT sareng stabilitas E-cadherin, 17,28 kami hipotésis kana keterlibatan sinyal PI3K-AKT.Sajaba ti éta, urang observasi blistering subepidermal dina sababaraha embryos mutant urang nu lolos lethality (<5%) dina E9.5-10.5 jeung gantina netep di sabudeureun E13.5 (Gbr. S3).Vesikel subepidermal mangrupikeun ciri khas tina pangurangan sinyal PI3K-AKT dumasar kana PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) ngalaporkeun yén gangguan tina aktivasina PI3K basis PDGFRα dina émbrio mutan PdgfraPI3K / PI3K nyababkeun vesikel subepidermal, defects tube neural, sareng phenotypes palate cleft.Mémang, tingkat pan-AKT sareng fosforilasi aktif Ser473-AKT diréduksi dina vivo dina jaringan mutant Specc1l ka E9.5 ditewak émbrionik (Gbr. 6A-D).Turunna tingkat phosphorylated Ser473-AKT bisa jadi sagemblengna alatan panurunan dina tingkat pan-AKT in vivo (Gbr. 6E) jeung in vitro (Gbr. 6F).Penurunan in vitro ngan dititénan nalika sél U2OS pakuat pisan sareng parobahan bentuk sél sareng dénsitas AJ (Gambar 6D).Ku kituna, data kami nunjukkeun yén SPECC1L mangrupakeun régulator positip novel PI3K-AKT signalling dina morphogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A,B) jeung E9.5 (C,D) bagian tangkorak atawa E9.5 lysates ti Specc1l émbrio mutant (E) némbongkeun tingkat phosphorylated aktif S473-AKT jeung pan-AKT réduksi Protéin , dibandingkeun jeung kontrol WT.Western blotting dipigawé dina lysates tipe liar sarta lysates mutant dina kaayaan anu sarua.Gambar anu dipidangkeun pikeun SPECC1L dicandak tina hiji blot.Blot anu sami dipiceun sareng ditaliti deui ku antibodi anti-pan-ACT sareng β-actin.tingkat Pan-AKT di E8.5 neural tilep (A, B) jeung tingkat phosphorylated S473-AKT dina bagian tangkorak E9.5 anu nyata ngurangan.(F) Tingkat Pan-AKT sami-sami ngirangan dina lysates sél SPECC1L-kd U2OS dipanén dina confluence tinggi.Kasalahan bar ngagambarkeun SEMs tina tilu bebas kuantitas blot Kulon.(GJ) Bagéan émbrio WT di E9.5 diwarnaan ku KI67 sareng caspase 3, masing-masing, nunjukkeun proliferasi sél (G, G ') sareng sakedik kagiatan apoptosis (H, H ').Émbrio mutant Specc11 nunjukkeun proliferasi sél anu sabanding (I), tapi jumlah sél anu ngalaman apoptosis ningkat sacara signifikan (J).
Urang teras nalungtik spidol proliferasi sareng apoptosis.Kami henteu ningali bédana dina proliferasi embrio E9.5 (Gbr. 6E, G dibandingkeun sareng I) kalayan indéks proliferasi 82.5% pikeun mutan WT sareng 86.5% pikeun mutan Specc1l diukur ku pewarnaan KI67 (p <0.56, Fisher's). tés pasti).Nya kitu, urang henteu niténan bédana dina apoptosis diukur ku staining pikeun dibeulah caspase 3 dina tilep neural di E8.5 dugi ditewak embrio (teu ditémbongkeun) (teu ditémbongkeun).Kontras, apoptosis ngaronjat sacara signifikan dina sakabéh émbrio mutant E9.5 (Gbr. 6F, H jeung J).kanaékan sakabéh apoptosis ieu konsisten kalayan ngurangan PI3K-AKT signalling sarta lethality émbrionik mimiti29,30,31.
Salajengna, pikeun ngonfirmasi peran kausal pikeun sinyal PI3K-AKT dina parobahan AJ dina sél kd urang, kami sacara kimia ngarobih jalur kontrol sareng sél kd (Gambar 7A-F).Urang dipaké salaku spidol phenotype parobahan bentuk sél dititénan dina sél SPECC1L-kd confluent, nu urang diitung ngagunakeun rasio dimensi pangpanjangna (panjangna) jeung dimensi nangtung pakait (lebar).Rasio 1 diperkirakeun pikeun sél anu kawilang buleud atanapi kuboid (Gambar 7G).Salian bentuk sél, urang ogé dikonfirmasi pangaruh dina AJ ku β-catenin staining (Gbr. 7A'-F').Inhibisi jalur PI3K-AKT nganggo wortmannin cekap pikeun ngarobih bentuk sél dina sél kontrol (Gambar 7A, C) sareng AJ (Gambar 7A ').Aktivator PI3K-AKT SC-79 henteu mangaruhan bentuk sél (Gbr. 7A, E) atanapi ékspansi AJ (Gbr. 7A ') dina sél kontrol.Dina sél SPECC1L-kd, suprési salajengna tina jalur PI3K-AKT nyababkeun ngaronjat apoptosis (Gbr. 7B, D) sarta ngaronjat dicirian dina β-catenin staining (Gbr. 7B '), konsisten kalawan mutan beurat in vivo urang.Anu penting, aktivasina jalur PI3K-AKT sacara signifikan ningkatkeun bentuk sél (Gambar 7B, F) sareng phenotypes AJ (Gambar 7B ").Parobahan bentuk sél diitung salaku rasio roundness sél (CCR) jeung dibandingkeun significance sakumaha ditétélakeun di luhur (Gbr. 7G).Mémang, dina sél kontrol (Gbr. 7G, CCR = 1.56), perlakuan wortmannin éta cukup pikeun nyata ngarobah bentuk sél (Gbr. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) ka extent sarupa hiji observasi. dina SPECC1L.sél -kd (Gbr. 7G, CCR = 3,46).Wortmannin perlakuan sél SPECC1L-kd (Gbr. 7G, CCR = 3.60, negligible) teu leuwih signifikan ti sél kd untreated (Gbr. 7G, CCR = 3.46, negligible) atawa sél kontrol wortmannin-diperlakukeun (Gbr. 7G)., CCR = 3,46, negligible) Sajaba mangaruhan elongation sél (7G, CCR = 3,61, negligible).Paling importantly, aktivator SC-79 AKT malikkeun phenotype elongated sél SPECC1L-kd (Gbr. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Hasil ieu mastikeun yén SPECC1L ngatur signalling PI3K-AKT sareng nunjukkeun yén panurunan sedeng dina SPECC1L mangaruhan adhesion sél, sedengkeun panurunan anu kuat nyababkeun apoptosis (Gbr. 8).
(A–F ') Control (A, C, E) jeung SPECC1L-kd (B, D, F) sél dirawat kalayan PI3K-AKT jalur inhibitor wortmannin (C, D) atawa SC-79 aktivator (E, F) perlakuan .Sél kontrol anu henteu dirawat nyaéta kuboid (A) kalayan pewarnaan sélular β-cat normal (A'), sedengkeun sél kd dipanjangkeun (B) kalayan paningkatan pewarnaan β-cat (B').Saatos suprési jalur PI3K-AKT, sél kontrol manjang (C) kalayan ékspansi β-cat (C'), sedengkeun sél kd mimiti ngalaman apoptosis (D), sami sareng émbrio anu mutasi pisan sareng nunjukkeun β-ucing anu ditingkatkeun pisan.pewarnaan (D').Saatos aktivasina jalur PI3K-AKT, sél kontrol tetep kuboidal (E) sareng ngagaduhan pewarnaan β-cat (E'), sedengkeun sél kd nunjukkeun paningkatan bentuk sél (F) sareng pewarnaan β-cat (F') sacara signifikan, nunjukkeun. (G) Derajat parobahan bentuk sél dina (AF) diitung ngagunakeun rasio roundness sél (CCR) tina dimensi pangpanjangna (panjang) jeung dimensi nangtung pakait (lebar) ngagunakeun software MetaMorph.Sél SPECC1L-kd anu teu dirawat (NT) (CCR = 3.46) sacara signifikan langkung panjang tibatan sél kontrol (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Inhibisi Wort tina jalur PI3K-AKT dina sél kontrol cekap pikeun nyababkeun elongasi anu sami dina bentuk sél (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Nya kitu, aktivasina AKT ku SC-79 dina SPECC1L-kd sél malikkeun elongation sél pikeun ngadalikeun tingkat (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Perlakuan Wortmannin sél SPECC1L-kd nyababkeun ngaronjat apoptosis tapi euweuh paningkatan salajengna dina parobahan bentuk sél (CCR = 3.60) dibandingkeun kd untreated (CCR = 3.46, ns) atawa sél kontrol wortmannin-diperlakukeun (3.61) observasi dina.ns = henteu masalah.+/- Pangukuran SEM pikeun 50 sél ditampilkeun.Bédana statistik diitung ngagunakeun t-test Student.
(A) Répréséntasi skéma tina inhibisi sareng aktivasina jalur PI3K-AKT nyababkeun parobahan AJ sareng nyalametkeun, masing-masing.(B) Modél anu diusulkeun pikeun stabilisasi protéin AKT ku SPECC1L.
Premigratory CNCCs merlukeun AJ lysis pikeun misahkeun tina anterior neural melu sél neuroepithelial1,15,32.Ngaronjat ngawarnaan komponén AJ sarta leungitna sebaran asimétri apical-basal AJ dina sél SPECC1L-kakurangan duanana in vitro na in vivo, digabungkeun jeung jarak fisik SPECC1L mun β-catenin, nunjukkeun yén SPECC1L fungsi bener ngajaga AJ stabilitas lokal pikeun otot organisasi.sitoskeleton aktin.Asosiasi SPECC1L sareng sitoskeleton aktin sareng β-catenin sareng paningkatan jumlah filamén aktin anu kentel dina henteuna SPECC1L konsisten sareng paningkatan anu dititénan dina dénsitas AJ.Kamungkinan sejen nyaeta ngaronjatna jumlah serat aktin dina sél SPECC1L-kakurangan ngabalukarkeun parobahan tegangan intercellular.Kusabab setrés sélular mangaruhan dinamika AJ 33, parobahan tegangan tiasa nyababkeun AJ 34 langkung sumebar.Ku kituna sagala parobahan bakal mangaruhan lapisan CNCC.
Wnt1 dinyatakeun dina tilep neural mimiti anu ngabalukarkeun sél crest neural.Ku kituna, Wnt1-cre garis tracing nandaan duanana pre- jeung migrasi NCC35.Sanajan kitu, Wnt1 ogé nandaan clones jaringan otak dorsal ogé diturunkeun tina tilep neural mimiti 35,36, sahingga kamungkinan yén staining kami tina mutan E9.5 pikeun spidol Wnt1 dina tilep neural kabuka teu CNCC.Pewarnaan positip kami pikeun spidol NCC AP2A sareng SOX10 dikonfirmasi yén lipatan saraf anu kakeunaan émbrio mutant Specc11 memang ngandung CNCC.Sajaba ti éta, saprak AP2A na SOX10 mangrupakeun spidol mimiti migrasi NCC, staining positif nunjukkeun yén sél ieu post-migratory CNCC nu teu bisa ngabedakeun lapisan ku E9.5.
Data kami nunjukkeun yén pangaturan molekular AJ ku SPECC1L dimédiasi ku sinyal PI3K-AKT.Sinyal AKT diréduksi dina sél sareng jaringan kakurangan SPECC1L.Papanggihan ku Fantauzzo et al.ngarojong peran langsung pikeun PI3K-AKT signalling dina morphogenesis craniofacial.(2014) némbongkeun yén kurangna aktivasina tina PDGFRα basis PI3K-AKT signalling ngabalukarkeun hiji phenotype palate cleft.Kami ogé nunjukkeun yén inhibisi jalur PI3K-AKT cukup pikeun ngarobih AJ sareng bentuk sél dina sél U2OS.Konsisten jeung papanggihan urang, Cain et al.37 némbongkeun yén downregulation tina subunit PI3K α110 dina sél endothelial ngakibatkeun kanaékan sarupa dina pericellular β-catenin staining, disebut salaku paningkatan dina "indéks konektipitas".Nanging, dina sél endothelial anu filamén aktinna parantos diatur pisan, suprési jalur PI3K-AKT nyababkeun bentuk sél anu leupas.Sabalikna, SPECC1L-kd U2OS sél nunjukkeun bentuk sél anu manjang.Bedana ieu bisa jadi tipe sél husus.Nalika suprési sinyal PI3K-AKT sacara permanén mangaruhan sitoskeleton aktin, pangaruh kana bentuk sél ditangtukeun ku parobahan tegangan disababkeun ku parobahan dénsitas sareng organisasi serat aktin sentral.Dina sél U2OS, kami ngan ukur nganggo parobahan bentuk sél salaku spidol parobahan sareng pamulihan AJ anu kakurangan SPECC1L.Dina kacindekan, urang hipotésis yén inhibisi jalur AKT dina kakurangan SPECC1L ningkatkeun stabilitas AJ sareng ngirangan delaminasi dina CNCC.
Narikna, tingkat pan-AKT dikirangan sacara in vitro sareng in vivo salian tingkat fosforilasi 473-AKT dina henteuna SPECC1L, nunjukkeun pangaturan sinyal PI3K-AKT dina tingkat stabilitas atanapi omzet protéin AKT.Gén SPECC1L sareng MID1, duanana pakait sareng sindrom Opitz/GBBB, ngodekeun protéin anu nyaimbangkeun mikrotubulus 18,22.Mékanisme dimana SPECC1L sareng MID1 nyapih stabilisasi mikrotubulus teu acan kahartos.Dina kasus SPECC1L, stabilisasi ieu kalebet ningkatna asetilasi sawaréh mikrotubulus 18.Kamungkinan SPECC1L ngagunakeun mékanisme anu sami pikeun nyaimbangkeun protéin sanés sapertos AKT.Eta geus ditémbongkeun yén asetilasi résidu lisin dina protéin AKT ngabalukarkeun panurunan dina lokalisasi mémbran jeung fosforilasi38.Sajaba ti éta, ubiquitination tina ranté K63 dina résidu lisin sarua dina AKT diperlukeun pikeun lokalisasi mémbran na activation39,40.Diantara sababaraha faktor interacting jeung protéin SPECC1L dicirikeun dina rupa throughput tinggi ragi layar dua-hibrida, opat - CCDC841, ECM2942, APC na UBE2I43 - geus implicated dina elehan protéin atawa stabilitas via ubiquitination atanapi sumoylation.SPECC1L tiasa kalibet dina modifikasi pasca-translasi résidu lisin AKT, mangaruhan stabilitas AKT.Nanging, peran kritis SPECC1L dina lokalisasi sareng stabilitas protéin AKT tetep dijelaskeun.
Cacat parah dina ekspresi SPECC1L dina vivo nyababkeun paningkatan pewarnaan spidol AJ sareng overlay CNCC anu cacad, ogé ningkat apoptosis sareng maotna émbrionik awal.Laporan saméméhna geus ditémbongkeun yén mutan mouse kalawan ngaronjat tingkat apoptosis pakait sareng defects tube neural 44,45,46,47 sarta defects craniofacial48.Eta geus ngusulkeun yén maot sél kaleuleuwihan dina tilep neural atawa arches pharyngeal bisa ngahasilkeun jumlah cukup sél diperlukeun pikeun gerakan morphogenetic ditangtoskeun 48,49,50.Sabalikna, garis sél kakurangan SPECC1L urang kalayan éksprési SPECC1L anu dikurangan ngan ukur nunjukkeun parobahan AJ tanpa bukti paningkatan maot sél.Nanging, inhibisi kimiawi jalur PI3K-AKT dina sél Kd ieu nyababkeun paningkatan apoptosis.Ku kituna, panurunan sedeng dina ekspresi atawa fungsi SPECC1L ensures survival sél.Ieu konsisten jeung observasi nu langka Specc11 embryos mutant nu kabur ditewak di St.E9.5-sugan alatan ngurangan efisiensi néwak gén-bisa nutup tabung neural maranéhanana sarta eureun engké dina ngembangkeun, sering kalawan defects craniofacial (Gbr. S3).Ogé saluyu jeung ieu kajadian langka tina émbrio Specc1l heterozygous kalawan Abnormalitas craniofacial-sigana alatan ngaronjat efisiensi néwak gén-kitu ogé kapanggihna di zebrafish nu salah sahiji dua orthologues SPECC1L (specc1lb) ngabalukarkeun phenotypes émbrionik telat, kaasup leungitna rahang handap sarta celah bilateral51.Ku kituna, mutasi leungitna-of-fungsi heterozygous SPECC1L dicirikeun dina penderita manusa bisa ngabalukarkeun impairments leutik dina fungsi SPECC1L salila morphogenesis craniofacial, cukup pikeun ngajelaskeun clefts orofacial maranéhanana.Pangaturan kontak antarsélular dumasar SPECC1L ogé tiasa maénkeun peran dina palatogenesis sareng fusi lengkung pharyngeal.Panaliti salajengna ngeunaan fungsi SPECC1L bakal ngabantosan ngajelaskeun peran kontak intersélular samentawis dina CNCC salami panutupanana tabung neural dina motilitas sél neuroepithelial sareng morfogenesis craniofacial.
Kontrol osteosarcoma U2OS sareng sél SPECC1L-kd parantos dijelaskeun sateuacana (Saadi et al., 2011).Antibodi ngalawan SPECC1L ogé geus dicirikeun saméméhna (Saadi et al., 2011).Antibodi anti-β-catenin (kelenci; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mouse; 1: 1000; Téhnologi Sinyal Sél, Danvers, MA), myosin IIb (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. ), MO)), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1: 1000; Téhnologi Sinyal Sél, Danvers, MA), pan-AKT (1: 1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Téhnologi Sinyal Sél, Danvers, MA), caspase 3 (1: 1000; Téhnologi Sinyal Sél, Danvers, MA) sareng β-aktin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. MO) dianggo sakumaha anu dijelaskeun..Filamén aktin diwarnaan ku Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Sél kontrol U2OS sareng sél SPECC1L-kd dibudidayakeun dina DMEM glukosa tinggi standar ditambah ku sérum bovine fétal 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Pikeun parobahan AJ, 2 x 105 sél anu seeded on kaca diperlakukeun kalayan 0,1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) jeung observasi pikeun parobahan bentuk sél.Sél dikumpulkeun dina titik waktu anu béda: 4 jam saatos penanaman (t = 1), 24 jam saatos penanaman (t = 2), confluence tanpa parobahan bentuk sél (t = 3), parobahan bentuk sél (t = 4) , 24 h sanggeus robah bentuk sél (t = 5) jeung 48 h sanggeus robah bentuk sél (t = 6) (Gbr. 1, 2, 3).Pikeun ngamodulasi jalur PI3K-AKT, sél dibudidayakeun dina konsentrasi anu dituduhkeun sareng wortmannin inhibitor PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) atanapi aktivator SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Médium anu ngandung bahan kimia dirobih unggal dinten.
Rékaman pigura-demi-pigura dilakukeun dina kontrol langsung sareng sél KD dina kaayaan budaya normal, sareng gambar kontras fase dikumpulkeun unggal 10 menit salami 7 dinten.Gambar dicandak nganggo mikroskop inverted Leica DM IRB anu dikontrol komputer anu dilengkepan panggung mékanis sareng tujuan 10 × N-PLAN disambungkeun ka kaméra QImaging Retiga-SRV.Salila pencitraan, kultur sél dijaga dina 37 ° C dina atmosfir lembab kalayan 5% CO2.
Dua gén trap ES garis sél DTM096 na RRH048 ti Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) dipaké pikeun ngahasilkeun Specc11 garis mouse kakurangan, ditunjuk Specc1lgtDTM096 na Specc1lgtRRH046.Sakeudeung, 129 / REJ ES sél disuntik kana blastocysts C57BL6.Beurit jalu chimeric anu dihasilkeun dikawinkeun sareng beurit C57BL6 bikang pikeun ngaidentipikasi turunan anu nganggo warna jaket agouti.Ayana inserts vektor bubu gén ieu dipaké pikeun ngaidentipikasi heterozigotes.Beurit dijaga dina latar campuran 129 / REJ; C57BL6.Lokasi situs panempatan vektor bubu genetik dikonfirmasi ku RT-PCR, sequencing génom, sareng pelengkap genetik (Suplemén Gambar 1).Pikeun ngalacak garis keturunan CNCC tina beurit Specc1lGT heterozygous ganda, ROSAmTmG (# 007576) sareng beurit Wnt1-Cre (# 003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME) diseberang pikeun ngahasilkeun alél ROSAmTmG sareng Wnt1-Cre dina embcryosl mutant.Sadaya ékspérimén dina beurit dilaksanakeun dumasar kana protokol anu disatujuan ku Panitia Perawatan sareng Pamakéan Sato Institusional di Pusat Médis Universitas Kansas.
Émbrio dibereskeun dina (1% formaldehida, 0,2% glutaraldehida, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) salila 60 mnt dina suhu kamar.Saatos fiksasi dina leyuran pewarnaan X-gal (5 mM kalium ferricyanide, 5 mM kalium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% natrium deoxycholate, 0,02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Ngembangkeun noda dilaksanakeun dina 37 ° C. .°C dina 1-6 jam.Émbrio parantos dipasang dina 4% PFA sareng ditingali.
Pikeun Western blotting, sél lysed dina panyangga lysis pasip (Promega, Fitchburg, WI) supplemented kalawan campuran HALT sambetan protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates diolah dina 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gels siap-dijieun (Bio-Rad, Hercules, CA) sareng ditransfer kana mémbran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Mémbran diblokir dina susu 5% dina PBS ngandung 0,1% Tween.Antibodi diinkubasi sapeuting dina suhu 4 ° C atanapi sajam dina suhu kamar.Femto SuperSignal West ECL réagen (Thermo Scientific, Waltham, MA) dipaké pikeun ngahasilkeun sinyal.Pikeun immunostaining, émbrio dibenerkeun sapeuting dina 4% PFA / PBS sareng cryopreserved.Cryosections jaringan diblokir dina PBS ngandung 1% sérum embe normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) jeung 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lajeng inkubasi dina 4 ° C dina incubator salila peuting.kalawan anti-antibodi jeung antibodi sékundér fluoresensi (1:1000) salila 1 jam dina 4 ° C.Bagian patri disimpen dina médium emas ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) sareng gambar datar dicandak nganggo mikroskop confocal Leica TCS SPE.Unggal immunostaining dipigawé salaku tilu percobaan bebas dina cirossections sahenteuna dua embrio mutant.Hiji percobaan wawakil ditémbongkeun.
Sél diinkubasi dina panyangga RIPA anu dirobih (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 mM EDTA, sareng HALT inhibitor protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Sakeudeung, lysates anu prepurified kalawan protéin G manik magnét (Life Technologies, Carlsbad, CA) lajeng inkubasi sapeuting dina 4 ° C. kalawan anti-SPECC1L atanapi IgG protéin manik protéin G anu dipaké pikeun nimba SPECC1L sarta Western blotting ieu dipigawé ngagunakeun anti-SPECC1L. antibodi -β-catenin ditétélakeun di luhur The percobaan ko-IP ditémbongkeun téh wawakil opat percobaan bebas.
Sél kultur tetep atanapi jaringan émbrionik beurit disayogikeun ka pusat mikroskop éléktron di Pusat Médis Universitas Kansas.Sakeudeung, sampel dipasang dina résin EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), dipolimérisasi sapeuting dina 60 ° C, sareng dipisahkeun dina 80 nm nganggo ultramicrotome Leica UC7 anu dilengkepan sabeulah inten.Bagian anu visualized maké JEOL JEM-1400 transmisi éléktron mikroskop dilengkepan gun 100 kV Lab6.
Kumaha carana nyebatkeun artikel ieu: Wilson, NR et al.Kakurangan SPECC1L ngakibatkeun ningkat stabilitas sendi spliced ​​sareng ngirangan delaminasi sél crest neural kranial.élmu.6, 17735;doi: 10.1038 / srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksi sareng diferensiasi crest neural.(Springer Élmu + Média Usaha; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Sél crest neural kranial dina gerak: peranna dina ngembangkeun craniofacial.Amérika Journal of Genetika Médis.Bagian A 155A, 270–279, doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: tumuwuhna sarta ngembangkeun leuwih 20 taun.Dokter anak.patologi.laboratorium.landong.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU jeung Noten MM narabas dina genetika of clefts orofacial.Tren dina Kedokteran Molekul 17, 725-733, Doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. jeung Riley, FM mékanisme molekular migrasi sél crest neural kranial na patterning salila ngembangkeun craniofacial.Ngembangkeun 137, 2605-2621, Doi: 10.1242 / dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH jeung Murray, JK Cleft lip na palate: pamahaman genetik jeung pangaruh lingkungan.komentar alam.Genetika 12, 167-178, Doi: 10.1038 / nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogenesis abnormal tina kulit, anggota awak, sarta wewengkon craniofacial dina interferon-pangaturan faktor-6 (Irf6) -beurit kakurangan.Genette Nasional.38, 1335–1340, Doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutasi dominan dina GRHL3 ngabalukarkeun sindrom van der Waord sarta ngaruksak ngembangkeun periderm lisan.Am J Hum Genet 94, 23–32, Doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ sareng Juriloff, DM Apdet daptar mutan beurit kalayan cacad dina panutupanana tabung neural sareng kamajuan nuju pamahaman genetik lengkep ngeunaan panutupanana tabung neural.Panalungtikan ngeunaan cacad kalahiran.Bagian A, klinis jeung Molekul Teratology 88, 653-669, Doi: 10.1002 / bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-dimédiasi PDGFRalpha signalling ngatur survival sarta proliferasi dina ngembangkeun rangka ngaliwatan jalur intrasélular p53-gumantung.Pangwangunan gén 28, 1005-1017, Doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Héjo, ND na Murdoch, JN Disheveled: Hubungan ékspansi convergent ka panutupanana tube neural.Tren dina neurologi.26, 453-455, Doi: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).