347 stainless steel coiled tubing komponén kimiawi, Idéntifikasi novél interferon-responsif leukosit manusa antigen-A (HLA-A) protéin chaperone maké cross-linked spéktrometri massa (CLMS)

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.

Panjelasan Produk

Stainless Steel 347L Coil tabung, Steel Kelas: SS347L

Sistem sinyal interferon ngainduksi réspon sitokin anu kuat kana rupa-rupa sinyal patologis patogén sareng intrinsik ti lingkungan, nyababkeun induksi sawaréh protéin interferon-inducible.Urang nerapkeun DSS-dimédiasi cross-link mass spectrometry (CLMS) pikeun ngadeteksi interaksi protéin-protéin anyar dina domain protéin interferon-ngainduksi.Salian protéin interferon-inducible ekspektasi, urang ogé ngaidentipikasi novél intermolecular na intramolecular cross-numbu adducts of canonical interferon-inducible protéin kayaning MX1, USP18, OAS3, sarta STAT1.Urang difokuskeun validasi ortogonal tina susunan novél jaringan protéin interferon-inducible dibentuk ku protéin HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ngagunakeun ko-immunoprecipitation jeung ulikan satuluyna maranéhanana ngagunakeun modeling dinamika molekular.Modeling dinamika konformasi kompleks protéin ngungkabkeun sababaraha situs interaksi anu ngagambarkeun interaksi anu diidentifikasi dina papanggihan CLMS.Kalawan babarengan, urang nampilkeun ulikan pilot of CLMS pikeun ngaidentipikasi kompléx signalling anyar ngainduksi ku interferon, sarta ngarepkeun pamakéan lega CLMS pikeun ngaidentipikasi dinamika anyar interaksi protéin dina microenvironment tumor.
Saméméh réspon imun adaptif dimimitian, sistem pertahanan bawaan inangna masang réspon antimikroba anu dimédiasi ku kulawarga sitokin alfa-hélik anu disékrésikeun anu disebut interferon (IFNs).Kelas IFN tipe I IFNα sareng IFNβ ngaktifkeun réspon sélular, kalebet kaayaan antivirus, proapoptotik, proinflamasi, sareng antiproliferatif.Dina manusa, 13 subtypes of IFNα dipikawanoh, sadayana clustered on kromosom 91. Ahéng, ngan IFNα2 geus ditalungtik pikeun pamakéan klinis.Nu anyar, perhatian husus geus dibayar ka panalungtikan dina subtipe séjén IFNα.Panaliti anyar nunjukkeun yén IFNα14 mangrupikeun salah sahiji isoform anu paling efektif dina ngawatesan réplikasi HBV2 sareng HIV-13,4 dibandingkeun sareng subtipe IFNα2 kanonik.
Parantos ditetepkeun yén kompléx reséptor interferon tipe I diaktipkeun (IFNAR1 sareng IFNAR2) memicu kaskade transduksi sinyal anu dimédiasi ku Janus kinase TYK2 sareng JAK15,6.Janus kinase ieu transduser sinyal fosforilasi sareng aktivator protéin transkripsi (STAT1 sareng STAT2) dina résidu tirosin pikeun ngamimitian heterodimerisasi dimédiasi domain SH26.Salajengna, IRF9 ngiket STAT heterodimers pikeun ngabentuk kompléx trimeric tina gén faktor 3 IFN-dirangsang (ISGF3), nu translocates kana inti jeung induces transkripsi leuwih 2000 interferon-dirangsang gén (ISGs)5,6,7,8.
ISGs ngabentuk tulang tonggong tina sistem imun bawaan, utamana dina respon kana serangan virus.Salaku garis pertahanan munggaran ngalawan inféksi virus, sél gancang nyebarkeun interaksi éksténsif protéin sélular sareng rupa-rupa kagiatan biologis.Protéin ieu kalebet reséptor pangakuan pola, molekul sinyal, faktor transkripsi, sareng protéin anu ngagaduhan fungsi antivirus langsung, ogé régulator négatip tina réspon imun9.Seueur inpormasi ngeunaan kagiatan ISG asalna tina layar fungsional anu ngagunakeun layar overexpression10,11 atanapi téknik silencing gén (siRNA, RNAi sareng CRISPR)12,13 dimana ISG individu dikedalkeun atanapi dihambat sareng kagiatanana diuji dina sababaraha virus.Sanajan studi ieu geus nangtukeun sipat antiviral ISGs individu, mékanisme molekular kaayaan unggal ISG tetep umumna kanyahoan.Sacara umum ditarima yén loba protéin berinteraksi sareng hiji atawa leuwih sitokin pikeun mastikeun aktivitas pinuh, jadi boh ISG berinteraksi langsung atawa interaksi maranéhanana dimédiasi ku protéin sélular.Contona, ulikan proteomics photocrosslinked panganyarna ngaidentipikasi ATPase VCP / p97 salaku pasangan interaksi utama IFITM3, anu inhibisi ngabalukarkeun defects dina asihan lisosom, elehan, sarta cotransport of IFITM3 kalawan partikel viral 14.Ngagunakeun immunoprecipitation, urang ngaidentipikasi VAPA, protéin pakait vesicle, salaku pasangan interaksi jeung IFITM1 / 2/3 nu mediates maturation viral koléstérol-dimédiasi, sarta ieu dikonfirmasi ku ulikan sejen ngagunakeun ragi sistem dua-hibrida.Rojongan Ilmiah 15 , 16 .
Prosés biologis dasar anu aub dina suprési inféksi sareng transformasi ganas nyaéta presentasi antigen, anu dimédiasi ku molekul histocompatibility complex (MHC).Péptida (panjangna 8-12 asam amino) tina protéin anu dibeulah, ditungtungan prématur atawa salah lipatan, dimuat kana heterodimer MHC-I (diwangun ku ranté beurat jeung hampang MHC-I, disebut β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .Trimer MHC-I stabil anu dihasilkeun diangkut ka permukaan sél, dimana aranjeunna nampilkeun péptida intrasélular kana sél T CD8+ (sél T sitotoksik)17.Sél T mikawanoh sareng ngancurkeun patogén ieu sareng sél anu mawa antigén khusus tumor.Akibatna, patogén jeung sél tumor mindeng ngurangan prosés presentasi antigen pikeun nyegah panjagaan imun.Sajaba ti éta, MHC-I ieu downregulated dina 40-90% tina tumor manusa sarta mindeng pakait sareng prognosis poorer19.
Gén anu kalibet dina ngaréspon patogén kedah gancang ngalih antara kaayaan istirahat sareng kaayaan transkripsi aktip.Ku alatan éta, sababaraha protéin sélular anu hipotésis aub dina respon kana paménta IFN tinggi leuwih période pondok waktu, kaasup remodeling sarta modifikasi tina promoter chromatin 20,21.Paling studi geus fokus kana idéntifikasi pasangan protéin ISG individu ku ayana IFN.Sababaraha studi proteomic jeung transcriptomic dina sistem sél modél geus elucidated pangaruh IFN dina bentang sélular.Sanajan kitu, sanajan pamahaman tumuwuh tina dinamika ngainduksi ku interferon, urang masih terang saeutik ngeunaan involvement of ISGs.Nalika ningal pajeulitna sareng dinamika sinyal interferon anu gumantung kana waktos, dua patarosan timbul: (i) naha mungkin pikeun nyaimbangkeun sareng bubu kompléx multiprotein aub dina sinyal gancang, sareng (ii) tiasa interaksi ieu dipetakeun kana rohangan 3D?
Pikeun ngabéréskeun masalah ieu, kami ngalaksanakeun succinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) gandeng sareng spéktrométri massa (CLMS) pikeun ngulik jaringan interaksi protéin anu diinduksi IFNα sareng dinamika na.DSS nambahkeun beungkeut kovalén antara résidu proksimal protéin jeung/atawa kompléx protéin dina vivo.Analisis MS saterusna nembongkeun situs crosslinking husus nu ngagambarkeun jarak spasial wewengkon dina protéin nu tangtu, disebut beungkeut internal, atawa subunit dina kompléx protéin, disebut interrelationships.Ngagunakeun pendekatan ieu, kami geus ngaidentipikasi sababaraha kompléx protéin-protéin novel ogé jaringan interaksi multiprotein interferon-ngainduksi.Ku nguji salajengna subset tina interaksi anyar ieu, urang demonstrate yén H2BFS (H2B histone-tipe FS; hereinafter disebut H2B) jeung MDN1 meta salaku mitra mengikat keur HLA-A.
Sél Flo-1 mangrupikeun salah sahiji modél in vitro anu paling dikenal tina adenocarcinoma esophageal sabab meniru fitur konci tumor esophageal22,23.Sanajan kitu, teu sakabeh tumor anu immunogenic, sarta pikeun nangtukeun lamun sél Flo-1 ngabales perlakuan interferon, urang ngarawat sél Flo-1 kalawan 10 ng / ml IFNα pikeun 72 jam.Sél Flo-1 némbongkeun induksi awal pSTAT1 na IRF1, dimimitian 2 jam sanggeus perlakuan jeung neraskeun pikeun 72 jam, kalawan panurunan waktu-gumantung dina tingkat cicing tina IRF1 (Gambar 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, sareng ISG15) kapanggih pisan ngainduksi saatos jam 6, niru réspon fase pertengahan sareng telat klasik pikeun IFNα (Gambar 1A).Kalawan babarengan, data ieu nunjukkeun yén modél sélular ieu bisa dipaké pikeun diajar réspon interferon.
Réspon éksprési protéin diferensial dina sél Flo-1 saatos perlakuan IFNα.(A) Ekspresi protéin dina sél Flo-1 dirawat kalayan 10 ng / ml IFNα pikeun jam 2, 6, 24, 48 sareng 72 dianalisis ku immunoblot nganggo antibodi ISG anu dituduhkeun.(B) Coomassie biru patri SDS-PAGE gél tina sakabeh ékstrak sél sanggeus cross-linking kalawan DSS keur waktu dituduhkeun sarta konsentrasi.(C) Perwakilan immunoblot ditaliti ku antibodi p53 (DO-1) tina sampel anu sami pikeun meunteun darajat protéin cross-linking.
Pikeun nangkep bentang interaksi protéin in situ, kami nganggo DSS, agén panyambung silang anu seueur dianggo kusabab perméabilitas mémbran anu luhur sareng waktos réaksi anu pondok.Waktu réaksi anu leuwih pondok mantuan pikeun nyegah formasi agrégat badag protéin crosslinked, kukituna ngajaga stabilitas crosslinker nu.Pikeun nangtoskeun konsentrasi DSS anu optimal sareng ngahindarkeun over-crosslinking, urang mimiti ngungkabkeun sél kana 5, 2.5, sareng 1 mM DSS masing-masing pikeun 5, 10, 5, sareng 30 menit, sareng nganalisis lysates ku Coomassie-stained SDS-PAGE. (data teu ditémbongkeun).Lysates sél sigana pisan cross-numbu dina konsentrasi panghandapna sarta dina titik waktu shortest.Ku alatan éta, DSS dititrasi jadi 1, 0,5, jeung 0,1 mM salila 5 menit (Gambar 1B).Crosslinking optimal dititénan ku 0,5 mM DSS salila 5 menit, sarta kaayaan ieu dipilih pikeun sél dirawat kalayan IFNα.Salaku tambahan, Gambar 1C nunjukkeun blot Kulon anu dilakukeun nganggo antibodi p53 (DO-1) pikeun meunteun darajat protéin cross-linking.
Sél Flo-1 dirawat kalayan 10 ng / ml IFNα salami 24 jam sateuacan nambihan crosslinker.Sél cross-numbu anu salajengna lysed ku proteolysis dua-hambalan jeung protéin anu diolah ku FASP (Gbr. 2) 24,25.Péptida tryptic cross-numbu dianalisis ku spéktrometri massa (Gbr. 2).Spéktra MS/MS lajeng dicocogkeun jeung runtuyan protéin jeung diukur ku MaxQuant26,27.Péptida cross-numbu dicirikeun tina spéktrum diala ngagunakeun program SIM-XL, sarta sanyawa individu digabungkeun kana jaringan kompléks ngagunakeun xQuest28 na SIM-XL29 open source komputasi software pipelines (Gbr. 2).SIM-XL ngaidentipikasi interaksi protéin-protéin, ranté internal tur ranté individu dina campuran protéin basajan atawa kompléks jeung nyadiakeun Aksara pikeun visualizing interaksi dina struktur protéin.Salaku tambahan, éta pangkat unggal rujukan silang salaku skor ID numutkeun kualitas spéktrum MS / MS29.Sababaraha interaksi protéin-protéin anu kacida dipercaya jeung kompléx geus dicirikeun, sarta susunan anyar interaksi geus ditalungtik satuluyna maké ko-immunoprecipitation jeung parobahan konformasi kompléx ngagunakeun dinamika molekular (MD) modeling (Gbr. 2) 30, 31.
Tinjauan skéma tina métode CLMS.Sél Flo-1 dirawat kalayan 10 ng / ml IFNα pikeun 24 jam dituturkeun ku in situ protéin cross-linking maké DSS dituturkeun ku lisis sél jeung trypsinization.Sampel cross-link dianalisis nganggo spéktrométer massa Orbitrap sareng salajengna disampel pikeun fragméntasi prékursor péptida salami LC-MS / MS.Dua péptida numbu diidentifikasi tina spéktra anu diala nganggo program Mesin Pangenal Spéktrum tina Péptida Crosslinked (SIM-XL), sareng sadaya sanyawa digabungkeun kana jaringan kompléks nganggo jalur pipa komputasi.Nyaring interaksi kapercayaan low dumasar kana skor laju positif palsu (FDR).Sababaraha interaksi protéin-protéin kasatiaan luhur anyar dikonfirmasi deui nganggo co-immunoprecipitation, sareng parobahan konformasi dina komplek ditaliti nganggo modél dinamika molekular (MD).
Jumlahna aya ~ 30,500 sareng ~ 28,500 péptida dideteksi nganggo MaxQuant dina sampel IFNα anu teu dirangsang sareng dirangsang (Tabel Tambahan S1, Gbr. 3A).Sebaran panjang péptida dina duanana kasus némbongkeun proporsi luhur péptida gedé, nunjukkeun ayana péptida cross-numbu (Gbr. 3B,C).Sajaba ti éta, proporsi gedé péptida gedé hadir dina rentang 40-55 dina sampel IFNα-diperlakukeun (Gbr. 3C).Pemetaan protéin ngalawan inténsitas log2 nunjukkeun yén protéin anu dirangsang interferon klasik anu paling seueur dibandingkeun sareng conto anu henteu dirawat, kalebet MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, sareng HLA-F (Gambar 3D).Analisis jalur pikeun protéin leuwih ti tilu kali lipet enriched dina respon kana perlakuan IFNα ngagunakeun database jalur Reactome némbongkeun yén MHC-I-dimédiasi antigen presentasi jeung ngolah éta jalur paling dominan (Gambar 3E).Konsisten sareng laporan saméméhna, réspon antiviral dimédiasi ku OAS sareng ISG15 ogé IFNα / β sareng sinyal sitokin mangrupikeun jalur anu diaktipkeun.Salaku tambahan, lysine- sareng serine-spésifik protéin cross-links diidentifikasi tina spéktrum MS / MS anu asalna nganggo SIM-XL.Panaliti anyar ngalaporkeun 104 ISG anu ngalangkungan 20 virus tina 9 kelas virus ku meta-analisis studi overexpression ISG individu dina 5 jinis sél9.Nanging, pikeun ngatasi watesan komputasi tina saringan set data ageung, urang mimitian ku set data anu langkung alit pikeun ngajalajah kamungkinan interaksi antara daptar gén IRDS anu dilaporkeun ku Padaria et al., anu kalolobaanana nyaéta ISG.
Idéntifikasi protéin cross-numbu anu béda-béda pikeun ngaréspon kana IFNα (data dicandak tina MaxQuant).(A) diagram Venn ngalambangkeun jumlah péptida umum tur ekslusif dicirikeun dina IFNα14 dirawat sarta untreated Flo-1 sampel.Distribusi panjang péptida sampel crosslinked anu henteu dirawat (B) sareng IFNα dirawat (C).(D) Peta panas ngalambangkeun log2 (inténsitas LFQ) antara untreated na IFNα14 dirawat sél Flo-1.Panel kénca nunjukkeun protéin anu paling aktip diaktipkeun ku ayana IFNα.(E) Histogram ngalambangkeun 20 jalur pengayaan utama sanggeus perlakuan IFNα.Pangkalan data jalur Reactome nganalisis langkung ti opat kali parobihan dina protéin IFNα-responsif anu ditingkatkeun.
Stimulasi ISG anu dimédiasi ku interferon didokumentasikeun saé, tapi dina tingkat molekular éta kirang kahartos kumaha puncak protéin ieu dina rupa-rupa fungsi biologis.Kami nalungtik interaksi protéin kalayan tingkat kapercayaan anu luhur antara ISG anu dipikanyaho.Narikna, kami ngaidentipikasi jaringan kalebet protéin MX1, USP18, ROBO1, OAS3, sareng STAT1 anu ngabentuk kompleks ageung pikeun ngaréspon perlakuan IFNα (Gambar 4, Tabel S2) 32,33,34.Paling importantly, interaksi ieu kapanggih dina sakabéh triplicates diperlakukeun kalayan IFNα sarta teu kapanggih dina sampel untreated, suggesting yén maranéhna kabentuk husus dina respon kana perlakuan IFNα.Perlu dipikanyaho yén STAT1 sacara transkripsi ngatur ekspresi ISG ieu, tapi interaksina sareng ISG dina tingkat protéin henteu acan ditaliti.Struktur kristal STAT1 némbongkeun yén domain hélik na (CCD) henteu aub dina interaksi jeung DNA atawa protomer salila formasi dimers35.α-héliks ieu ngabentuk struktur héliks héliks nu nyadiakeun aréa permukaan utamana hidrofilik pikeun interaksi lumangsung 35 .Dina data CLMS urang, urang katalungtik yén lolobana interaksi jeung STAT1 lumangsung dina domain SH2 saméméh CCD, domain linker, atawa buntut C-terminal (résidu 700-708) (Gambar 4A).Hiji studi saméméhna dilaporkeun yén USP18 ngiket ka CCD jeung DNA-mengikat domain (DBD) tina STAT2 sarta direkrut ka subunit sahiji tipe I interferon reséptor IFNAR2 pikeun nyapih inhibisi tipe I interferon signalling 24.Data kami ogé nunjukkeun yén domain katalitik USP18 berinteraksi sareng STAT1 DBD (Gambar 4A, D), nunjukkeun yén STAT1 sareng STAT2 tiasa maénkeun peran dina narik USP18 ka IFNAR2.
Protéin-protéin jaringan ISG dicirikeun dina sél cross-numbu dirawat kalayan IFNα.(A) Plot interaksi 2D nunjukkeun interaksi protéin-protéin (dihasilkeun dina program SIM-XL), kalayan garis anu ngagambarkeun interaksi antarmolekul (crosslink cutoff disetel ka 3.5).Domain tina idéntitas anu béda ditandaan ku warnana32: domain MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), sareng GED (569–660).OAS3 domain: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), sarta OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) jeung fn3 (777–864).Widang STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), jeung STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular panempo protéin cross-numbu (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, sarta STAT1) kalawan interaksi jeung interaksi dilabélan dina biru jeung beureum, mungguh.The bangbarung cross-link disetel dina 3.5.Plot titik nunjukkeun situs interaksi STAT1 sareng MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), sareng OAS3 (F), ogé situs interaksi K atanapi S antara dua péptida.Dina gambar, bangbarung skor cross-link disetel ka 3.0.(G) Rupa-rupa situs interaksi antara STAT1 na OAS3 DI domain superimposed on struktur protéin maranéhanana di PyMol (Sistem grafik molekular PyMOL, versi 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) jeung OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Dua isoforms of USP18 geus dijelaskeun dina manusa, protéin full-panjang anu utamana ayana dina inti, sarta isoform tanpa domain N-terminal, USP18-sf, nu disebarkeun merata dina sitoplasma jeung inti 36.Salaku tambahan, N-terminus diprediksi henteu terstruktur sareng henteu meryogikeun kagiatan isopeptidase atanapi beungkeutan ISG1537.Kaseueuran interaksi anu diidentipikasi dina pangajaran urang aya di terminal N protéin, nunjukkeun yén interaksi ieu ngalibatkeun USP18 panjangna (Gambar 4A, D) sahingga kamungkinan lumangsung dina inti.Leuwih ti éta, data urang ogé nunjukkeun yén N-terminus husus pikeun interaksi protéin-ka-protéin.Situs beungkeutan IFNAR2 perenahna di antara résidu 312-368, sareng khususna, teu aya protéin dina kompleks anu ngabeungkeut daérah ieu (Gbr. 4A) 37,38.Data ieu dicandak babarengan nunjukkeun yén domain mengikat IFNAR2 sacara éksklusif dianggo ku protéin reséptor.Sajaba ti éta, ngan OAS3 na ROBO1 kapanggih pakait sareng domain hulu tina N-terminus jeung situs mengikat IFNAR2 (Gambar 4A).
ROBO1 milik immunoglobulin (Ig) superfamili molekul signalling transmembrane sarta diwangun ku lima domain Ig jeung tilu domain fibronectin (Fn) di wewengkon extracellular.Ieu domain ekstrasélular dituturkeun ku wewengkon mémbran-proksimal sarta héliks transmembran tunggal 39. Wewengkon intrasélular teu terstruktur perenahna di C-terminus sarta ngandung motif runtuyan conserved nu nyapih beungkeutan protéin effector39.Wewengkon ngalegaan ti asam amino ~ 1100 nepi ka 1600 lolobana teu kaganggu.Kami mendakan yén MX1 berinteraksi sareng ROBO1 ngalangkungan Ig, Fn, sareng domain intrasélular, sedengkeun kalolobaan interaksi sareng STAT1 lumangsung antara CCD, domain linker, sareng terminal C ROBO1 (Gbr. 4A, E).Di sisi séjén, interaksi jeung DI, DIII, sarta OAS3 wewengkon linker disebarkeun sapanjang protéin ROBO1 (Gbr. 4A).
Kulawarga protéin oligoadénylate synthase (OAS) narima jeung ngiket intrasélular double-stranded RNA (dsRNA), ngalaman parobahan konformasi, sarta sintésis 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 .Ieu kapanggih yén diantara tilu OASs, OAS3 némbongkeun pangirut pangluhurna pikeun dsRNA jeung sintésis jumlah sahenteuna 2-5 As, nu bisa ngaktipkeun RNase L sahingga ngawatesan réplikasi viral 41.Kulawarga OAS diwangun ku polimérase béta (pol-β) -kawas domain transferase nukléotida.Panalungtikan saméméhna geus ditémbongkeun yén kagiatan katalitik tina domain C-terminal (DIII) gumantung kana dsRNA-ngariung domain (DI), nu diperlukeun pikeun aktivasina of OAS342.Kami ningali yén domain DI sareng DII tina OAS3 berinteraksi sareng CCD sareng daérah simpang leutik antara SH2 sareng STAT1 TAD (Gambar 4A, F).Overlaying situs crosslinking béda dina struktur protéin ngungkabkeun hiji interaksi antara β-lambar jeung DBD STAT1 loop sarta kantong kabuka atawa rongga dibentuk ku résidu 60-75 dina domain DI of OAS3 (Gbr. 4G).Orientasi protéin dina komplek ogé nunjukkeun yén teu aya interaksi sareng OAS3 anu ngaganggu kamampuan ngariung DNA tina domain DI na (Gbr. S1A).Sajaba ti éta, domain N-terminal GTPase MX1 interaksi éksténsif jeung DI na DIII domain OAS3 (Gbr. 4A).Kami ogé ningali interaksi antara OAS1 sareng MX1 dina sadaya tilu ulangan anu dirawat IFNα, dimana domain OAS1 tunggal (ogé aktif sacara katalitik) berinteraksi sareng tilu domain MX1 (Gambar S2A, B).
Protéin MX mangrupikeun bagian tina kulawarga ageung GTPase sapertos dynein anu ngandung domain GTPase terminal-N anu ngabeungkeut sareng ngahidrolisis GTP, domain perantara anu nyéépkeun rakitan diri, sareng seleting leucine terminal-C anu bertindak salaku GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.MX1 ngiket kana subunit polimérase virus pikeun meungpeuk transkripsi gen virus43.A ragi saméméhna dilaporkeun layar dua-hibrid némbongkeun yén PIAS1-pakait MX1 ngahambat aktivasina gén STAT1-dimédiasi ku blocking aktivitas DNA-mengikat sarta ogé mibanda aktivitas ligase SUMO E344,45.Di dieu, urang nunjukkeun yén MX1 ngiket ka STAT1 (Gambar 4C, D), kumaha ogé kumaha interaksi ieu mangaruhan aktivasina gén anu dimédiasi STAT1 pikeun ngaréspon kana IFNα peryogi diajar satuluyna.Sajaba ti éta, urang ogé kapanggih yén MX1 berinteraksi sareng IFIT3 na DDX60 dina sakabéh tilu ulang IFNα-diperlakukeun (Gbr. S2C).
DDX60 mangrupikeun hélikase sitoplasma anu diinduksi IFN anu saacanna dilaporkeun maénkeun peran dina degradasi RIG-I-bebas tina RNA46 virus.Éta berinteraksi sareng RIG-I sareng ngaktifkeun sinyalna ku cara khusus ligand 46. DDX60 diwangun ku domain helikase DEXD / H-Box sareng domain hélikase terminal C anu ngabeungkeut RNA sareng DNA47 virus.Kalolobaan interaksi na kalawan MX1 na IFIT3 lumangsung dina panjang N- sarta wewengkon C-terminal tanpa domain canonical atawa motif (Gbr. S2E, F).Sanajan kitu, MX1 ogé pakait sareng DEXD / H-Box domain helicase (Gbr. S2E).Protéin kulawarga IFIT gaduh salinan tandem tina motif héliks-péngkolan-héliks anu disebut ulang tetrapeptide (TPR).IFIT3 kapanggih janten modulator positip tina sinyal RIG-I sareng janten komponén tina kompleks MAVS.Dicokot babarengan, data kami nunjukkeun yén IFIT3 na DDX60 berinteraksi utamana di wewengkon antara TPR 3-6 of IFIT3 sarta bisa maénkeun peran dina RIG-I / MAVS signalling (Gbr. S2F).
Nunjukkeun yén saringan sadayana proteome sacara intensif sacara komputasi, kami teras nyaring sadayana database UniProt manusa pikeun ayana salah sahiji ulangan anu dirawat ku IFNα.Dina réplika ieu, kami mendakan sababaraha jaringan interaksi anu tiasa dipercaya pikeun HLA-A.Analisis jalur protéin diidentipikasi ku MS / MS spéktra némbongkeun yén MHC-I basis ngolah antigen jeung presentasi teh jalur utama ngainduksi ku interferon (Gbr. 3D).Ku alatan éta, urang museurkeun kana diajar interaksi protéin molekul MHC-I kalayan tingkat kapercayaan luhur dina sakabéh sampel cross-numbu.HLA diwangun ku domain α1, α2 sareng α3 sareng ranté cahaya, sareng microglobulin β2 (β2m) mangrupikeun protéin chaperone konstan49.Sakali dirakit dina retikulum endoplasmic, HLA teu stabil dina henteuna ligan péptida50.Alur beungkeut péptida dibentuk ku domain α1 jeung α2 anu kacida polimorfik jeung teu terstruktur dina wangun non-péptida jeung domain α351 anu rélatif kurang polimorfik.Dina ayana IFNα, urang ngadeteksi dua kompléx HLA-A: hiji berinteraksi sareng HMGA1 sareng H2B (Gambar 5, Tabel S3) sareng anu sanésna berinteraksi sareng MDN1, LRCH4 sareng H2B (Gambar 6).
IFNα ngainduksi jaringan interaksi HLA-A sareng H2B (H2BFS) sareng HMGA1.(A) plot 2D (dihasilkeun dina software SIM-XL) ngagambarkeun tipena béda interaksi dina kompléks H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (biru), interlink (beureum) jeung link tunggal (hideung)..Domain tina idéntitas anu béda nyaéta warna coded32: H2B (histone; 2-102) sareng MHC-I (MHC_1; 25-203, grup C1; 210-290 sareng MHC_I_C; 337-364).The bangbarung cross-link disetel dina 3.5.Plot titik nunjukkeun situs interaksi HLA-A sareng H2B (B) sareng HMGA1 (C), ogé situs interaksi K atanapi S antara dua péptida.Dina gambar, bangbarung skor cross-link disetel ka 3.0.(D) Hubungan antara protéin ditémbongkeun dina struktur protéin H2B, HLA-A, sarta HMGA1 dina program PyMOL.Struktur ieu dimodelkeun nganggo server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) sareng struktur template pikeun protéin H2B, HLA-A sareng HMGA1 masing-masing 1kx552, 1kj349 sareng 2eze55.
IFNα ngainduksi jaringan interaksi HLA-A sareng H2B (H2BFS), MDN1 sareng LRCH4.(A) Intramolecular (beureum) jeung intermolecular (biru) crosslinks dibere dina peta interaktif 2D (dihasilkeun dina software SIM-XL) kalawan MDN1 digambarkeun salaku bunderan.The bangbarung cross-link disetel dina 3.5.Domain tina idéntitas anu béda nyaéta warna disandi32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 jeung MHC_I_C; 337–364) jeung LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) jeung CH (535-641)).(B) Hubungan antara protéin ditémbongkeun dina struktur protéin H2B, HLA-A, LRCH4, sarta MDN1 dina program PyMOL.Struktur ieu dimodelkeun nganggo server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kalayan struktur template 1kx552, 1kj349, 6hlu62 sareng 6i2665 pikeun protéin H2B, HLA-A, LRCH4 sareng MDN1, masing-masing.Plot titik nunjukkeun situs interaksi K atanapi S pikeun HLA-A sareng H2B (C), LRCH4 (D), sareng MDN1 (E).Pikeun plot, ambang skor cross-link disetel ka 3.0.
Salian ngajaga integritas génom, histone H2B ogé kalibet dina pangaturan transkripsi.Protéin H2B diwangun ku hiji domain histone sentral (HFD) diwangun ku tilu α-héliks dipisahkeun ku loop sarta buntut C-terminal 41,52.Kalolobaan interaksi jeung H2B lumangsung dina héliks α1, nu nyadiakeun trimerization kalawan HFD heterodimer (Gbr. 5A,B).Sanajan lisin aub dina beungkeutan DNA, sababaraha lisin ogé acetylation alternatif atawa situs methylation.Contona, résidu K43, K46, jeung K57 ti H2B teu kalibet dina beungkeutan DNA langsung, tapi mangrupakeun udagan rupa modifikasi post-transcriptional53.Nya kitu, résidu K44, K47, jeung K57 dina H2B bisa maénkeun peran alternatif dina ayana IFNα, kaasup interaksi jeung protéin séjén (Gbr. 5A, B).Salaku tambahan, histon ekstrakromosomal H2B ngaktifkeun réspon imun dina sababaraha jinis sél, ngalaksanakeun sénsor sitosolik pikeun ngadeteksi fragmen DNA (dsDNA) untaian ganda anu diturunkeun tina agén inféksi atanapi sél anu ruksak54.Dina ayana virus DNA, depletion H2B ngahambat produksi IFN-β jeung STAT154 fosforilasi.H2B ogé dipikawanoh pikeun pindah asup jeung kaluar inti leuwih gancang batan histones inti séjén54.Interaksi H2B sareng MDN1 sareng LRCH4 ogé dititénan dina sampel anu henteu dirawat.Urang manggihan yén HLA-A berinteraksi sareng H2B dina sakabéh tilu sampel IFNα-diperlakukeun na dina hiji sampel ulang untreated.Data ieu ngagambarkeun peran H2B dina fungsi fisiologis alternatif bebas tina régulasi transkripsi.
HMGA1 (grup mobilitas tinggi AT-Hook 1), nukléoprotein leutik anu beunghar ku asam amino anu ngamajukeun panyakit, parantos diidentifikasi pakait sareng HLA-A.Mibanda buntut C-terminal asam sarta tilu DBD béda disebut AT hook sabab ngabeungkeut alur minor wewengkon AT-euyeub dina dsDNA55,56.Beungkeutan ieu ngabalukarkeun DNA ngabengkokkeun atawa ngalempengkeun, sahingga faktor transkripsi kanonik ngakses runtuyan konsensus na.Buntut C-terminal dipercaya kalibet dina interaksi protéin-protéin jeung rekrutmen faktor transkripsi, sabab mutan penghapusan C-terminal teu bisa ngamimitian transkripsi57.Leuwih ti éta, domain ieu ngandung sababaraha situs fosforilasi conserved nu dipikawanoh substrat pikeun kinase 58.Urang observasi HLA-A jeung H2B interaksi jeung HMGA1 luar domain C-terminal, suggesting yén domain C-terminal utamana dipaké pikeun faktor transkripsi mengikat (Gbr. 5A, C).Protéin HMGA bersaing jeung histone H1 pikeun ngariung kana adaptor DNA, ku kituna ngaronjatkeun aksésibilitas57.Nya kitu, sigana kamungkinan yén HMGA berinteraksi sareng histone H2B sapanjang linker DNA dina kompetisi jeung histone H1.HMGB1 nyababkeun éksprési HLA-A, -B, sareng -C dina sél déndritik, ngarah kana aktivasina59, tapi interaksi antara HMG sareng HLA teu acan dilaporkeun sateuacana.Kami mendakan yén HMGA1 berinteraksi sareng domain α1 sareng α3 HLA-A, sareng kalolobaan interaksi di luar 3 DBD na (Gambar 5A, C).Dina panangan urang, HLA-A kapanggih dilokalkeun dina inti (data henteu ditingalikeun), sareng nunjukkeun yén H2B sareng HMGA1 ogé aya dina inti, interaksi ieu sigana lumangsung dina inti.Adducts husus diukur antara H2B, HLA-A, sarta HMGA1 ditémbongkeun dina Gambar 5D.
Kalolobaan interaksi HLA-A jeung protéin séjén lumangsung dina domain α1 jeung α2 sarta domain C-terminal disordered (Gbr. 6).Dina salah sahiji conto ieu, kami mendakan yén HLA-A berinteraksi sareng buntut N-terminal gangguan tina LRCH4 (Gambar 6A, D).LRCH4 ngatur aktivasina TLR4 na LPS cytokine induksi, kukituna modulating respon imun leuleuy60,61.Éta protéin mémbran kalayan salapan ulangan anu beunghar leucine (LRRs) sareng motif homologi calmodulin (CH) dina ectodomain na, dituturkeun ku domain transmembrane (TMD) 60, 62.Domain CH geus dilaporkeun pikeun nyapih interaksi protéin-protéin 60.A manteng ngeunaan 300 asam amino antara domain LRR jeung CH relatif diaksés tapi disordered.Dumasar kana fungsi wewengkon disordered salaku mediator jaringan protéin-protéin jeung angkutan vesicular 63, urang manggihan yén paling interaksi protéin lumangsung di wewengkon disordered.Interaksi sareng MDN1 disebarkeun sapanjang panjang protéin, kalebet LRR1, LRR6, domain CH, sareng daérah acak, sedengkeun H2B utamina kabeungkeut kana domain CH (Gbr. 6A, B).Utamana, teu aya interaksi anu kalebet TMJ, nunjukkeun spésifisitas pendekatan CLMS (Gambar 6A, B).
MDN1 ogé parantos diidentifikasi minangka bagian tina jaringan protéin HLA-A (Gambar 6A).Ieu milik kulawarga AAA protéin (ATPases pakait sareng kagiatan béda).Ieu sarua N-terminal domain AAA nu organizes kana cingcin hexameric sarta ngaluarkeun faktor assembly tina 60S 64 subunit ribosom.katingalina sami sareng dynein64,65,66.Sajaba ti éta, wewengkon euyeub Asp/Glu dituturkeun ku domain MIDAS (situs gumantung ion logam).Kusabab ukuran MDN1 anu ageung (kira-kira 5600 asam amino) sareng homologina terbatas sareng protéin anu ditaliti, sakedik anu dipikanyaho ngeunaan struktur sareng fungsina dina manusa.Kami ngaidentipikasi HLA-A, H2B, sareng LRCH4 salaku mitra beungkeutan MDN1 sareng ngungkabkeun orientasina salaku kompleks protéin dina PyMol (Gbr. 6A, B).Tilu protéin ieu berinteraksi sareng domain AAA, domain linker sapertos dynein, sareng kamungkinan domain MIDAS MDN1.Dina laporan saméméhna, purifikasi pangirut protéin bait dicirikeun MDN1 salaku protéin pakait sareng histone H2B67.Salaku tambahan, panilitian anyar ogé ngalaporkeun interaksi antara MDN sareng HLA-B dina sél HCT116 nganggo spéktrométri massa anu dimurnikeun afinitas, ngadukung penemuan kami68.Idéntifikasi kompléks ieu dina sampel IFNα-diperlakukeun nunjukkeun peran MDN1 dina signalling interferon.
Kusabab gén HLA kacida polymorphic, urang sasari sequencing maca pemetaan HLA-A, -B, jeung -C tina data sequencing RNA sél Flo-1 (data teu ditémbongkeun).Runtuyan péptida konsisten jeung bacaan sequencing ngungkabkeun béda anu signifikan antara HLA-A, -B, jeung -C di wewengkon mana péptida cross-numbu ayana dina HLA-A (Gambar S3).Sajaba ti éta, urang teu niténan protéin-ka-protéin cross-linking molekul HLA-B / C jeung protéin H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4.Ieu nunjukkeun yén interaksi protéin kapanggih antara HLA-A, MDN1, LRCH1 na HMGA1 nyaeta HLA-A husus.Sajaba ti éta, analisis proteomic sampel non-crosslinked (Table S4) némbongkeun yén HLA-A boga sinyalna runtuyan luhur dibandingkeun HLA-B atanapi HLA-C.Péptida anu diidentipikasi pikeun HLA-A éta inténsitas tinggi dina duanana sampel IFNα-diperlakukeun jeung untreated.
Pikeun mastikeun yén interaksi anu diidentipikasi di dieu sanés kusabab cross-linking non-spésifik dua protéin dina jarak spasial caket, kami salajengna dikonfirmasi dua faktor interaksi HLA-A anyar ku ngajalankeun assays ko-immunoprecipitation.HLA-A interaksi jeung endogenous MDN1 na H2B anu kauninga dina duanana IFNα-diperlakukeun na untreated Flo-1 sél (Gambar 7, Gambar S4).Kami negeskeun yén HLA-A direbut ku H2B dina immunoprecipitates sareng yén asosiasi ieu kusabab perlakuan IFNα saprak HLA-A henteu aya dina conto immunoprecipitate tina sél anu teu dirawat (Gambar 7A).Nanging, data kami nunjukkeun yén IFNα sacara béda ngatur HLA-A ngariung kana H2B sareng MDN1.IFNα induces pakaitna antara H2B jeung HLA-A, tapi ngurangan pakaitna jeung MDN1.Kami mendakan yén MDN1 pakait sareng HLA-A dina kadali, sareng tambihan IFNα ngirangan interaksi ieu bebas tina induksi MDN1 ku IFNα (Gambar 7B, C).Sajaba ti éta, immunoprecipitation HLA-A direbut H2B dina sél A549 (Gbr. S4), suggesting yén interaksi ieu bebas tina tipe sél.Dihijikeun, hasil ieu ngarojong interaksi interferon-dimédiasi HLA-A kalawan H2B na MDN1.
HLA-A co-purify H2B jeung MDN1.Perwakilan endogenous H2B (A) jeung MDN1 (B) immunoblots anu immunoprecipitated tina IFNα-diperlakukeun Flo-1 sél jeung probed pikeun antibodi dituduhkeun.Beurit jeung kelenci IgG dipaké salaku kontrol négatip.(C) Jumlah relatif (input) antigén béda digambarkeun ku immunoblots probed ngalawan antibodi dituduhkeun, β-aktin dipaké salaku kontrol loading.
Sipat struktural tina salah sahiji interferon-ngainduksi kacida dipercaya jaringan cross-numbu, H2B-HLA-A-HMGA1, ditalungtik.Kami nganggo modél dinamika molekular salaku pendekatan alternatif pikeun ngartos dinamika konformasi protéin anu aub dina kompleks ieu (Gambar 8).Inferensi tina data CLMS nunjukkeun kamungkinan konformasi anu béda tina protéin H2B, HLA-A, sareng HMGA1.Ku alatan éta, kompléx poténsi handap ieu dimodelkeun dina medium pangleyur: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, sarta H2B-HLA-A-HMGA1.Hiji layar docking protéin-protéin awal ngagunakeun MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Canada) ngasongkeun konformasi kamungkinan anu béda antara protéin ieu (Gbr. 8A).Visualisasi kompleks protéin docking ngungkabkeun sababaraha interaksi sareng kamungkinan konformasi (Gambar 5A, 8).Ku kituna, hiji konformasi mungkin ditémbongkeun dina Gambar 8A (kalawan dilabélan cross-tumbu) sarta eta ieu salajengna dievaluasi ngagunakeun MD modeling pipa.Sajaba ti éta, beungkeutan H2B atanapi HMGA1 kana HLA-A highlights pangirut luhur H2B pikeun HLA-A (Gbr. 8A).
Dinamika konformasi jaringan mungkin antara H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, jeung H2B-HLA-A-HMGA1 kompléx.(A) Panel kénca mangrupa peta 2D (dihasilkeun dina software SIM-XL) tina crosslinks intramolecular (beureum) jeung intermolecular (biru) (crosslink cutoff disetel ka 3,5).Salaku tambahan, résidu panyambung silang anu diidentifikasi dilabélan dina struktur protéin H2B, HLA-A, sareng HMGA1.Konformasi pakait protéin ieu sasari ngagunakeun pipa docking dilaksanakeun dina pakét MOE.Panel kénca handap nembongkeun rupa-rupa konformasi mungkin tina kompléx H2B-HLA-A jeung HMGA1-HLA-A kalawan afinitas beungkeutan protéin-protéin béda (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(B) Simpangan baku (RMSD) tina posisi atom (teu kaasup atom hidrogén) pikeun tiap struktur protéin.(C) Intermolekul protéin-protéin interaksi beungkeut hidrogén ti sagala rupa kompléx simulasi tempo interaksi husus durasi ≥ 10 ns.Jarak cutoff donor-acceptor ikatan h disetel ka 3,5 Å, sareng sudut cutoff donor-H-acceptor disetel ka ≥ 160 ° -180 °.(D) Résidu anu dilabélan ngabentuk interaksi protéin-protein HLA-A sareng mitra masing-masing, ngalangkungan ≥ 20 ns, sasari tina kompleks HLA-A-H2B sareng HLA-A-HMGA1 dummy.Struktur protéin ngagambarkeun struktur rata-rata 100 ns MDS.(E) Interaksi antara HLA-A-H2B jeung HLA-A-HMGA1 kompléx dibandingkeun interaksi dilacak ku simulasi H2B-HLA leuwih 100 ns dumasar kana situs interaksi K atawa S antara dua péptida.Kompléks / HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Nilai bangbarung pikeun meunteun cross-links disetel ka 3.0, sarta interaksi husus ti MDS nyokot ≥ 10 ns dicokot kana rekening.Struktur protéin divisualisasikeun nganggo BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, AS) sareng bungkusan Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Kanada).
Stabilitas molekul HLA-A kana waktosna (standar deviasi; RMSD atanapi standar deviasi; RMSF) nunjukkeun yén ayana H2B atanapi HMGA1 protéin dina kompléx stabilized HLA-A (Gambar 8B, Gambar S5).Protéin HMGA1 ngabeungkeut pageuh kana situs B2M HLA-A, ngainduksi stabilitas asam amino HLA-A dina kompleks HLA-A-HMGA1 atanapi H2B-HLA-A-HMGA1 (Gambar 8B, Gambar S5).hususna, résidu HLA ~ 60-90 jeung ~ 180-210 kapanggih kirang fléksibel dina ayana H2B (Gbr. 8B).H2B na HMGA1 némbongkeun hadé ngariung ka HLA-A dina H2B-HLA-A-HMGA1 kompléks dibandingkeun HLA-A mengikat H2B atanapi HMGA1 nyalira (Gambar 8C, D; Table S5).Résidu aub dina beungkeutan hidrogén (MD dimodelkeun occupancy tinggi ≥ 10 ns) coincide jeung loka interaksi CLMS (K atawa S résidu) dina komplek, suggesting yén interaksi dicirikeun ku CLMS pisan dipercaya.Réliabilitas (Gbr. 8E).Dina modeling CLMS jeung MD, résidu HLA-A antara kira 190-210 jeung kira-kira 200-220 asam amino kapanggih ngabeungkeut H2B jeung HMGA1, masing-masing (Gbr. 8E).
Interaksi protéin-protéin ngabentuk jaringan struktural dinamis nu nyapih komunikasi intrasélular dina respon kana rangsangan tangtu.Kusabab loba pendekatan proteomics ngadeteksi parobahan dina sakabéh tingkat kaayaan ajeg tina protéin, dinamika interaksi protéin-protéin merlukeun parabot tambahan pikeun néwak interfaces mengikat, sarta CLMS mangrupakeun salah sahiji alat sapertos.Sistem sinyal interferon nyaéta jaringan sitokin anu ngamungkinkeun sél pikeun ngaréspon sauntuyan sinyal patologis patogén sareng intrinsik lingkungan, anu puncakna dina induksi sawaréh protéin interferon-inducible.Kami nerapkeun CLMS pikeun nangtukeun naha interaksi protéin-protéin novél tiasa diidentifikasi diantara panel protéin anu diinduksi interferon.Analisis cross-linking protéin global dina modél sél Flo-1 interferon-responsif dipaké pikeun nangkep kompléx protéin.Ékstraksi péptida tryptic tina sél non-silang-numbu jeung cross-numbu ngamungkinkeun pikeun cacah péptida, pengayaan jalur, jeung distribusi panjang péptida jeung inténsitas LFQ tangtu.Protéin canonical interferon-inducible diidentifikasi minangka kontrol internal anu positif, sedengkeun intermolekul jeung intramolekul anyar cross-numbu adducts protéin interferon-inducible canonical kayaning MX1, UP18, OAS3 jeung STAT1 anu observasi.Rupa-rupa fitur struktural sareng interaksi di daérah fungsional parantos ditalungtik.
Interaksi antara HLA-A, MDN1 sareng H2B dideteksi ku immunoblotting dina sél Flo-1 sareng A549 anu dirawat sareng henteu dirawat kalayan IFNα.Hasil kami nyorot yén kompléx HLA-A sareng H2B dina cara anu gumantung kana IFNα.Karya urang ngagambarkeun jalan metot pikeun éksplorasi salajengna ngeunaan ko-lokalisasi dua kompléx ieu.Éta ogé bakal pikaresepeun pikeun dilegakeun pendekatan CLMS ka panel garis sél pikeun ngaidentipikasi interaksi protéin anu dimédiasi interferon-sél-tipe mandiri.Tungtungna, kami nganggo modél MD salaku pendekatan alternatif pikeun ngartos dinamika konformasi protéin anu aub dina kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, anu ngalacak cross-talk intramolecular sareng intermolecular.Inferensi tina data CLMS nunjukkeun kamungkinan konformasi anu béda tina protéin H2BFS, HLA-A, sareng HMGA1.Kemungkinan konformasi anu béda antara kompléx protéin docking ieu ngungkabkeun sababaraha interaksi anu sami sareng anu dititénan dina dataset CLMS.Salah sahiji kaunggulan utama métode urang téh nya éta ngamungkinkeun idéntifikasi gampang tina interacting gén kacida polymorphic kayaning HLA, jadi eta bakal metot pikeun diajar interaksi protéin haplotype-spésifik HLA nu disebutkeun hese diajar.Dihijikeun, data kami nunjukkeun yén CLMS tiasa dianggo pikeun ngalegaan pamahaman kami ngeunaan jaringan sinyal anu diinduksi interferon sareng nyayogikeun dasar pikeun diajar sistem intersélular anu langkung kompleks dina lingkungan mikro tumor.
Sél Flo-1 dicandak ti ATCC sarta dijaga dina DMEM (Gibco) supplemented kalawan 1% pénisilin / streptomycin (Invitrogen), 10% sérum bovine boh (Gibco) jeung disimpen dina 37 ° C jeung 5% CO2.Inkubasi.Sél anu tumuwuh nepi ka 70-80% confluence saméméh dirawat kalayan IFNα14 (dijieun ku Edinburgh Protéin Fasilitas Produksi).Sadaya bahan kimia sareng réagen sanésna dipésér ti Sigma Aldrich upami henteu dicatet.
Sél Flo-1 dibudidayakan dina pelat 6-sumur sarta poé saterusna sél dirawat kalayan 10 ng/ml IFNα14 salila 24 jam nepi ka kira-kira 80% confluence.Sél anu dikumbah tilu kali kalawan PBS na ligated kalawan Freshly disiapkeun DSS (Thermo Fisher Scientific) (leyur dina DMSO) dina PBS pikeun 5 mnt dina 37 ° C. nepi ka konsentrasi ahir 0,5 mM.Réaksi crosslinking DSS diganti ku PBS sareng sésa DSS dipareuman ku nambihan 20 mM Tris (pH 8.0) dina PBS salami 15 menit dina suhu 37 ° C.Sél dikumpulkeun ku scraping sarta dikumpulkeun dina tabung low mengikat (Axygen).
Pelet sél dilisiskeun ku 300 µl panyangga lisis uréa (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) salami 30 menit dina suhu kamar sareng oyag.Sadaya léngkah centrifugation dilakukeun dina 14.000 xg dina 8 ° C.Centrifuge lysate salila 10 menit sarta mindahkeun supernatant kana tube anyar.Sésana partikel jelas leyur dina 150 μl panyangga lisis kadua (2 M uréa, 2% (w/v) SDS (natrium dodecyl sulfate)) salila 30 menit atawa leuwih nepi ka leyuran cai homogen dicandak.Lysate ieu centrifuged pikeun 20 menit jeung supernatant ieu dicampur jeung lysate diala dina hambalan saméméhna.Konsentrasi protéin ditaksir nganggo uji Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) numutkeun petunjuk produsén pikeun prosedur microplate.Sampel gancang beku dina nitrogén cair sareng disimpen dina -80 ° C.
Kira 100 μg protéin cross-link larut diolah ngagunakeun filtration sample préparasi protokol (FASP) dirobah sakumaha ditétélakeun ku Wisniewski et al.69 Sakeudeung, protéin dikaitkeun silang jeung 200 µl buffer urea (8 M urea dina 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexed jeung satengah.Sadaya léngkah centrifugation dilakukeun dina 14.000 xg dina 25 ° C.Satengah kahiji tina lysate protéin cross-numbu ditransferkeun ka 10 kDa Microcon alat centrifugal filter dilengkepan hiji mémbran Ultracel-10 (Merck), dituturkeun ku centrifugation on filter pikeun 25 menit.Teras tambahkeun satengah kadua protéin kana saringan sareng ngulang léngkah anu sami.Pamulihan protéin dilaksanakeun ku cara nambahkeun 100 μl 17 mM tris(2-carboxythyl)phosphine hydrochloride (TCEP) dina panyangga uréa.Pamulihan diaduk dina thermomixer dina 600 rpm salila 30 menit dina 37 ° C.Sajaba ti éta, kolom ieu centrifuged sarta protéin cross-numbu ngurangan ieu alkylated maké 100 μl of 50 mM iodoacetamide dina panyangga uréa.Réaksi alkilasi dilaksanakeun dina suhu kamar salila 20 menit dina poék.Puterkeun kolom, cuci témbok kolom 3 kali nganggo 100 µl buffer urea, teras centrifuge.Operasi anu sami dilaksanakeun 3 kali nganggo 100 μl 100 mM amonium bikarbonat.Sateuacan trypsinization, gentos tabung koleksi ku anu énggal.Tambahkeun panyangga pencernaan anu ngandung 50 mM amonium bikarbonat sareng 1 µl tripsin anu éncér dina panyangga tripsin (Promega).Babandingan tripsin jeung protéin dijaga kira-kira 1:33, sarta réaksi nyerna diinkubasi sapeuting dina suhu 37°C dina kamar anu lembab.Péptida crosslinked ieu éluted tina filter ku sentrifugasi salila 25 menit.Pamulihan péptida ditingkatkeun ku nambahkeun 50 μl 0,5 M NaCl kana saringan, dituturkeun ku sentrifugasi salila 25 menit.
C18 Micro Spin kolom (Harvard Apparatus) dipaké pikeun nyalurkeun péptida tryptic cross-numbu nuturkeun protokol digambarkeun ku Bouchal et al.70 kalawan modifikasi minor.Sakeudeung, kolom spin C18 diaktipkeun ku tilu washes of 0.1% asam format (FA) dina acetonitrile (AcN) (Merck) jeung dua washes of 0.1% FA.Kolom dihidrasi ku 0,1% FA salami 15 menit.Beban sampel kana kolom spin jeung ngumbah 3 kali kalayan 0,1% FA.Péptida desalted ieu sequentially eluted kalawan gradién stepwise ngagunakeun 50%, 80% jeung 100% AcN dina 0.1% FA.Sampel dikeringkeun dina konsentrator SpeedVac Plus (Eppendorf) dugi ka cairan sésa-sésa ngaleungit.Péptida éluted dibubarkeun dina 100 μl asam trifluoroacetic 0,08% dina 2,5% AcN sareng konsentrasina diukur dina NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Kira 1 μg péptida crosslinked per sampel ieu nyuntik kana sistem LC-MS / MS.
Péptida cross-link dipisahkeun dina sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) disambungkeun ka spéktrométer massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Péptida cross-linked dikumpulkeun dina ID 300 µm, 5 mm panjang µ-pre-column C18 capture column dipak ku C18 PepMap100 sorbent sareng 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Beban aliran pompa diatur dina 5 µl / mnt 0,08% asam trifluoroacetic leyur dina 2,5% AcN.Péptida cross-link dipisahkeun dina kolom silika lebur analitik kalayan diaméter jero 75 μm sareng panjang 150 mm, dieusian ku sorben PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Fase mobile A sareng B diwangun ku 0.1% FA dina cai sareng 0.1% FA dina asetonitril, masing-masing.Gradién dimimitian dina 2,5% B sarta naek linier nepi ka 40% B salila 90 menit, lajeng ka 90% B salila 2 menit salajengna.Komposisi fase gerak dijaga dina 90% B salami 10 menit teras turun sacara linier ka 2,5% B salami 2 menit.Kolom disaruakeun dina 2,5% B salami 8 menit sateuacan siklus salajengna.Péptida cross-linked eluted tina kolom analitik ieu ionized dina sumber nanoelectrospray ionization (NSI) sarta nyuntik kana spéktrométer massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektrométer massa Orbitrap Exploris 480 dioperasikeun dina modeu korelasi data positif.A scan pinuh dipigawé dina modeu bagian dina resolusi 120.000 kalawan setélan rentang ti m / z 350 Th mun m / z 2000 Th.Target AGC anu dinormalisasi disetel dina 300% kalayan waktos input maksimal 50ms.Deteksi puncak monoisotopik parantos ditetepkeun pikeun péptida.Parameter rélaxasi konstrain disetel ka leres upami sakedik teuing prékursor anu kapendak.Kakuatan ionik minimum prékursor disetel ka 5.0e3 sareng muatan prékursor nyatakeun dugi ka +8 kalebet dina percobaan.
Waktu siklus antara scan utama dina modeu korelasi data disetel ka 2,5 detik.Pangaluaran massa dinamis disetel ka 20 detik saatos fragméntasi munggaran ion prékursor.Jandéla isolasi prékursor disetel ka 2 Th.Jinis énergi tabrakan anu dinormalisasi sareng mode énergi tabrakan tetep dipilih dina scan MS / MS anu gumantung kana data.Énergi tabrakan disetel ka 30%.Resolusi Orbitrap disetel ka 15,000 sareng target AGC ka 100%.Waktu suntik maksimum khusus disetel ka 60 milidetik.
Sateuacan nyukcruk jaringan protéin-protéin dina conto cross-linked, kami ngolah file atah nganggo pakét MaxQuant (versi 1.6.12.0)26,27 pikeun ngaidentipikasi péptida / protéin anu tiasa dilacak dina sampel.Salaku tambahan, analisa proteomik anu sami dilakukeun dina conto Flo-1 anu henteu kabeungkeut anu dirawat sareng henteu dirawat kalayan IFNα.Data MS/MS dipaluruh dina database manusa UniProt (www.uniprot.org) (diunggah 12 Agustus 2020, ngandung 75,093 éntri) ngagunakeun mesin pencari Andromeda27 anu diwangun.Pilarian dilaksanakeun tanpa nunjukkeun spésifisitas énzim sareng rupa-rupa modifikasi deamidasi (N, Q) sareng oksidasi (M).Toleransi massa prékursor diatur dina 20 ppm sareng ion produk dina 0,02 Da.Simpangan massa awal jeung maksimum disetel ka 10 ppm.Massa maksimum péptida diatur dina 4600 Da jeung runtuyan kasaruaan diatur antara 7 jeung 25 asam amino (aa).Analisis statistik salajengna dilaksanakeun nganggo program Perseus (versi 1.6.10.45).Eusi protéin diitung ku cara normalisasi inténsitas spéktral protéin (inténsitas LFQ; kuantitas henteu dilabélan)27 sareng nilai inténsitas dirobih janten Log2.A clustering hirarki protéin dicirikeun ku inténsitas péptida maranéhanana diwangun ngagunakeun pheatmap (v1.0.12) pakét dina R (v 4.1.2).Analisis pengayaan jalur dilaksanakeun nganggo database jalur Reactome pikeun protéin anu diolah IFNα anu langkung ti opat kali diaktipkeun dibandingkeun sareng sampel anu henteu dirawat.
Idéntifikasi lisin (K) atawa serine (S) crosslinks kimiawi husus kompléx protéin diawaskeun ku LC-MS / MS dipigawé maké mesin idéntifikasi spectroscopic (SIM-XL) pikeun péptida cross-numbu (SIM-XL)29.Kahiji, mungkin interaksi antara interferon-pakait (IFN) DNA karuksakan signature lalawanan (IRDS) gén ieu ditalungtik ngagunakeun IRDS dataset protéin digambarkeun dina Padariya et al.28.Saringan sadaya kaayaan sareng ulangan sadayana UniProt manusa sacara intensif sacara komputasi, janten sadayana database UniProt manusa (www.uniprot.org) (diunduh 12 Agustus 2020, ngandung 75,093 éntri) ngalawan ulangan anu dirawat IFNα.Salah sahiji saringan pikeun interaksi kapercayaan anu luhur.Interaksi anu penting-luhur ieu diala dilegaan sareng diuji dina sadaya pangulangan sareng kaayaan.
Dina SIM-XL, DSS dipaké pikeun crosslinker (XL) jeung shift beurat XL jeung shift beurat modifikasi disetel ka 138.06 jeung 156.07, masing-masing.Situs réaksi crosslinking di handap ieu dianggap: KK, KS sareng KN-TERM, tanpa ion reporter.Duanana prékursor sareng fragmén ppm disetel ka 20 sareng ambang Xrea disetel ka 0.15.Trypsin dianggap lengkep spésifik, sareng metode fragméntasi C-trap (HCD) énergi tinggi dilaksanakeun.Ambang pangurangan DB dinamis XCorr sareng jumlah minimum péptida pikeun réduksi DB dinamis disetel ka 2,5 sareng 2, masing-masing.Parameter séjén nyaéta: probabiliti monoisotop jeung cutoff kabeneran puncak, minimum 4 résidu AA per untaian jeung muatan untaian maksimum, jeung 3 maxima pamisah lasut.Hasilna peta 2D stitched dianalisis dina (SIM-XL) jeung xQuest28 ngagambarkeun grafis ieu dipaké pikeun ngawangun peta 2D.Crosslinks protéin dina struktur protéin disadiakeun dina PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versi 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktur model protéin dijieun maké server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ngagunakeun prinsip modeling homology sarta palaksanaan tina "Metode Markov disumputkeun".Phyre2 ngahasilkeun struktur modél dumasar kana alignment runtuyan jeung struktur protéin dipikawanoh.Pikeun protéin H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, sareng MDN1, struktur template 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, sareng 6i2665 dianggo.Salaku tambahan, struktur AlphaFold71 MX1, UBP18 sareng ROBO1 ogé dianggap.Struktur protéin divisualisasikeun nganggo pakét BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, AS) sareng pakét Lingkungan Operasi Molekul (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Kanada).