347 12.7 * 1.24mm Stainless steel coiled tubing, mékanisme molekular kondensasi éléktrostatik sinkron jeung coaggregation of α-synuclein jeung tau

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.

347 Spésifikasi pipa stainless steel

347 12.7 * 1.24mm Stainless steel coiled tubing

Diaméter Luar: 6,00 mm OD dugi ka 914,4 mm OD, Ukuran dugi ka 24 "NB sayogi Ex-stock, OD Ukuran Steel Tubes sayogi Ex-stock

SS 347 Range Ketebalan Pipa: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, jsb (0.5-12mm) Atawa ukuran non-regular bisa tailored sakumaha diperlukeun

Tipe: SS 347 Pipa Seamless |SS 347 pipah ERW |SS 347 dilas pipa |SS 347 Fabricated pipa |SS 347 tabung CDW, pipa LSAW / Kelim-dilas / Digambar ulang

Bentuk: SS 347 Pipa Bulat / Pipa, SS 347 Pipa Square / Pipa, SS 347 Rectangular Pipa / Pipa, SS 347 Pipa Coiled, SS 347 "U" Wangun, SS 347 Pan Kue Coils, SS 347 Pipa Hidrolik

Panjang: Tunggal Acak, Ganda Acak & Diperlukeun Panjang Tungtung: Polos Tungtung, Beveled Tungtung, Treaded

Protection tungtung: Caps palastik |Luar Finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Eunteung Finish pikeun pipa stainless steel, rengse sakumaha per Sarat customer

Kaayaan Pangiriman: Annealed na Pickled, Digosok, Bright Annealed, Tiis Digambar

Inspeksi, Laporan Uji: Sertipikat Uji Mill, EN 10204 3.1, Laporan Kimia, Laporan Mékanis, Laporan Uji PMI, Laporan Inspeksi Visual, Laporan Inspeksi Pihak Katilu, Laporan Lab anu Disatujuan NABL, Laporan Uji Ngancurkeun, Laporan Uji Non-Destructive

Bungkusan: Dipak dina kotak kayu, kantong plastik, strips baja dibuntel, atanapi sakumaha per requests konsumén

Specials: Ukuran jeung spésifikasi lian ti luhur bisa dijieun dina pamundut

SS 347 Pipa Rentang Ukuran: 1/2 inci NB, OD ka 24 inci

ASTM A312 347: Pipa austenitik dilas mulus sareng lempeng-seam dimaksudkeun pikeun suhu luhur sareng jasa korosif umum.Filler logam teu diwenangkeun salila las.

ASTM A358 347: Fusi listrik dilas pipa austenitik pikeun jasa korosif sareng / atanapi suhu luhur.Biasana ngan ukur pipa dugi ka 8 inci diproduksi pikeun spésifikasi ieu.Penambahan logam pangisi diidinan nalika las.

ASTM A790 347: Pipa feritik/austenitik (duplex) anu dilas mulus sareng lempeng dilas pikeun jasa korosif umum, kalayan tekenan khusus kana résistansi retakan korosi stres.

ASTM A409 347: Lempeng-seam atanapi spiral-seam fusi listrik dilas pipa lampu-tembok austenitik diaméterna ageung dina ukuran 14 "dugi ka 30" kalayan témbok Sch5S sareng Sch 10S pikeun korosif sareng / atanapi luhur.

ASTM A376 347: Pipa austenitik mulus pikeun aplikasi suhu luhur.

ASTM A813 347: Tunggal-seam, tunggal- atawa ganda-dilas pipa austenitic pikeun suhu luhur sarta aplikasi corrosive umum.

ASTM A814 347: Pipa austenitik anu dilas tiis pikeun suhu luhur sareng jasa korosif umum.

347H Pipa Stainless Steel Komposisi Kimia

Stainless Steel 347H pipe Sipat mékanis

Stainless Steel 347H Pipa Sipat fisik

Sasmita sarimbag pikeun 347H Stainless Steel Pipe

Agrégasi amyloid alpha-synuclein (αS) mangrupikeun ciri khas panyakit Parkinson sareng sinukléinopati sanés.Anyar-anyar ieu, protéin tau anu biasa dipatalikeun sareng Panyakit Alzheimer parantos dikaitkeun sareng patologi αS sareng kapanggih pikeun ngalokalkeun dina inklusi anu beunghar αS, sanaos mékanisme molekular koagregasi dua protéin tetep teu jelas.Kami ngalaporkeun di dieu yén fase αS misahkeun kana kondensat cair ngaliwatan kondensasi kompléks éléktrostatik sareng polipéptida anu muatanana positip sapertos tau.Gumantung kana afinitas αS pikeun polycations jeung laju depletion valénsi jaringan koagulasi, gumpalan ngalaman gelation gancang atawa coalescence dituturkeun ku aggregation amyloid slow.Ku ngagabungkeun hiji suite téhnik biofisika canggih, urang bisa characterize separation fase αS / Tau cair-cair jeung nangtukeun faktor konci nu ngakibatkeun formasi agrégat hétérogén ngandung duanana protéin dina condensate protéin cair.
Salian kompartemen mémbran, pamisahan spasial dina sél ogé bisa dihontal ku kabentukna protéin-euyeub protéin, kawas cair awak padet disebut biomolecular condensates atawa titik-titik, ngaliwatan prosés nu katelah liquid-liquid phase separation (LLPS).Titisan ieu kabentuk ku interaksi temporal multivalén, biasana antara protéin atawa protéin jeung RNA, sarta ngalayanan rupa-rupa fungsi dina ampir sakabéh sistem hirup.Sajumlah badag protéin LLP-sanggup némbongkeun runtuyan pajeulitna low nu kacida disordered di alam jeung dina formasi condensates biomolekul3,4,5.Seueur panilitian ékspérimén parantos ngungkabkeun sipat anu fleksibel, sering karusuhan, sareng multivalén tina protéin anu ngawangun kondensat sapertos cair ieu, sanaos sakedik anu dipikanyaho ngeunaan determinan molekular spésifik anu ngatur kamekaran sareng maturasi kondensat ieu janten langkung padet. kaayaan..
Data anyar ngadukung hipotésis yén LLPS anu didorong ku protéin anu nyimpang sareng transformasi tetesan kana struktur padet tiasa janten jalur sélulér anu relevan ngarah kana formasi agrégat toksik anu teu larut anu sering janten ciri tina panyakit degeneratif.Seueur protéin gangguan intrinsik (IDP) anu aya hubunganana sareng LLPS, sering pisan dicas sareng fleksibel, parantos lami dikaitkeun sareng neurodegeneration ngaliwatan prosés agrégasi amyloid.Khususna, kondensat IDP biomolekul sapertos FUS7 atanapi TDP-438 atanapi protéin anu domain kompleksitas rendah ageung sapertos hnRNPA19 parantos kabuktian umurna janten bentuk gél atanapi bahkan padet ngalangkungan prosés anu disebut fluidisasi.sanyawa.transisi fase padet (LSPT) salaku fungsi tina waktu atawa respon kana modifikasi post-translasi tangtu atawa mutations pathologically signifikan1,7.
IDP séjén anu aya hubunganana sareng LLPS in vivo nyaéta Tau, protéin gangguan anu aya hubunganana sareng microtubule anu agrégasi amiloid parantos aya hubunganana dina Panyakit Alzheimer10 tapi ogé nembé aya hubunganana dina kasakit Parkinson (PD) sareng protéinopati nuklir sinaptik sanés 11, 12, 13 aya hubunganana.Tau geus ditémbongkeun spontan dissociates tina solusi / sitoplasma alatan interaksi éléktrostatik nguntungkeun14, hasilna formasi tetes tau-enriched katelah coacervates éléktrostatik.Ogé geus katalungtik yén tipe interaksi non-spésifik ieu mangrupa gaya nyetir balik loba condensates biomolekul di alam15.Dina kasus protéin tau, agrégasi éléktrostatik bisa dibentuk ku agrégasi basajan, dimana wewengkon muatan sabalikna protéin memicu prosés pembelahan, atawa ku aggregation kompléks ngaliwatan interaksi jeung polimér muatan négatip kayaning RNA.
Anyar, α-synuclein (αS), hiji amyloid IDP implicated di PD jeung kasakit neurodegenerative séjén koléktif katelah synucleinopathy17,18, geus ditémbongkeun dina sélular jeung sato models19,20 kentel dina condensates protéin jeung kabiasaan kawas cairan.Studi in vitro nunjukkeun yén αS ngalaman LLPS ku agrégasi basajan ngaliwatan interaksi utamana hidrofobik, sanajan prosés ieu merlukeun konsentrasi protéin exceptionally tinggi na atypically lila inkubasi times19,21.Naha kondensat anu ngandung αS anu dititénan dina vivo dibentuk ku ieu atanapi prosés LLPS anu sanés tetep janten masalah anu teu tiasa direngsekeun.Nya kitu, sanajan agrégasi amiloid αS geus dititénan dina neuron di PD jeung synucleinopathies séjén, mékanisme pasti ku nu αS ngalaman aggregation amyloid intrasélular tetep can écés, sakumaha overexpression protéin ieu teu muncul pikeun memicu prosés ieu ku sorangan.Karusakan sélular tambahan sering diperyogikeun, nunjukkeun yén lokasi sélulér atanapi lingkungan mikro anu dibutuhkeun pikeun rénukleasi rakitan amiloid αS intrasélular.Hiji lingkungan sélular anu utamana rawan aggregation bisa jadi interior kondensat protéin 23 .
Narikna, αS jeung tau geus kapanggih ko-localize dina inclusions kasakit ciri dina manusa jeung kasakit Parkinson jeung synucleinopathies séjén 24,25 jeung percobaan geus ngalaporkeun hubungan patologis sinergis antara dua protéin 26,27 suggesting hubungan poténsial antara aggregation αS jeung tau dina kasakit neurodegenerative.panyawat.αS jeung tau geus kapanggih pikeun interaksi jeung ngamajukeun aggregation silih in vitro jeung in vivo 28,29 jeung aggregates hétérogén diwangun ku dua protéin ieu geus dititénan dina brains pasien kalayan synucleinopathies 30.Tapi, saeutik anu dipikanyaho ngeunaan dasar molekular interaksi antara αS sareng tau sareng mékanisme ko-aggregasi na.αS geus dilaporkeun berinteraksi sareng tau ngaliwatan daya tarik éléktrostatik antara wewengkon C-terminal muatan négatif kacida tina αS jeung wewengkon prolin-euyeub sentral tau, nu ogé enriched résidu muatan positif.
Dina ulikan ieu, urang némbongkeun yén αS memang bisa dissociate kana titik-titik ngaliwatan kondensasi kompléks éléktrostatik ku ayana protéin tau, kontras jeung interaksi na polipéptida muatan positif lianna kayaning poli-L-lisin (pLK), sarta dina prosés ieu.αS tindakan minangka molekul scaffold pikeun jaringan droplét.Kami geus ngaidentifikasi béda noticeable dina prosés maturation of coacervates αS éléktrostatik, nu pakait sareng béda dina valénsi jeung kakuatan interaksi protéin aub dina jaringan coacervate.Narikna, urang ningali ko-aggregasi protéin αS sareng tau amyloid dina coacervates cair umur panjang sareng ngaidentipikasi sababaraha faktor konci anu nyababkeun ko-aggregasi dua protéin ieu dina coacervates sapertos kitu.Di dieu urang ngajelaskeun sacara rinci prosés ieu, anu mangrupikeun mékanisme molekular anu mungkin dina dasar kolokalisasi dua protéin dina inklusi khusus panyakit.
αS boga buntut terminal C anu kacida anionik dina pH nétral (Gbr. 1a), sarta kami hipotésis yén éta bisa ngalaman LLPS ngaliwatan kondensasi kompléx éléktrostatik jeung molekul polipéptida disordered polycationic.Kami nganggo 100-résidu poli-L-lisin (pLK) salaku molekul modél awal kusabab sipat polimér anu muatanana positip sareng teu kaganggu dina pH nétral 32. Kahiji, kami negeskeun yén pLK berinteraksi sareng domain Ct of αS via spéktroskopi Solusi NMR. (Gambar 1b) ngagunakeun 13C/15N-dilabélan αS ku ayana ngaronjatna αS: pLK babandingan molar.Interaksi pLK jeung Ct-domain of αS manifests sorangan dina perturbations tina shift kimiawi jeung panurunan dina inténsitas puncak di wewengkon protéin ieu.Narikna, nalika urang nyampur αS sareng pLK dina konsentrasi αS kira-kira.5–25 µM ku ayana poliétilén glikol (5–15% PEG-8) (panyangga LLPS has: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) urang langsung ngaliwatan widang formasi protéin nu lega. .titik-titik dititénan maké mikroskop fluoresensi (WF) jeung caang-widang (BF) (Gbr. 1c).Tetesan 1-5 µm ngandung αS pekat (ditambahkeun 1 µM AlexaFluor488-dilabélan αS, AF488-αS), sipat éléktrostatikna tiasa diturunkeun tina résistansina ka 10% 1,6-héksanédiol (1,6-HD) sareng sensitipitasna kana paningkatan dina konsentrasi NaCl (Gbr. 1c).Sifat kawas cairan tina coacervates αS/pLK kompléx éléktrostatik dibuktikeun ku pangabisa maranéhna pikeun ngahiji dina milliseconds (Gbr. 1d).Ngagunakeun turbidimetry, urang ngitung formasi ogé titik-titik dina kaayaan ieu, dikonfirmasi sipat éléktrostatik tina interaksi utama pakait sareng stabilitas na (Gbr. 1e), sarta dievaluasi efek rupa babandingan polimér dina prosés LLPS (Gbr. 1f).Sanajan formasi tetesan dititénan dina rupa-rupa rasio polimér, prosésna pohara nguntungkeun nalika pLK ngaleuwihan αS.LLPs ogé geus katalungtik ngagunakeun agén displacing kimiawi dextran-70 (70 kDa) atawa ngagunakeun rupa-rupa format sampel, kaasup kaca slide tetes, microplate sumur rupa bahan, Eppendorf atanapi quartz kapiler.
a Répréséntasi skématik wewengkon protéin béda dina WT-αS jeung ΔCt-αS varian dipaké dina ulikan ieu.Domain N-terminal amphipathic, wilayah pembentuk amiloid hidrofobik (NAC), sareng domain terminal C bermuatan négatif masing-masing dipidangkeun dina warna biru, oranyeu, sareng beureum.Peta Net Charge Per Residual (NCPR) WT-αS ditembongkeun.b analisis NMR tina interaksi αS / pLK dina henteuna rumpun makromolekul.Nalika konsentrasi pLK ningkat (αS: pLK babandingan molar 1: 0,5, 1: 1,5, sareng 1: 10 dipidangkeun dina warna héjo caang, héjo, sareng héjo poék, masing-masing).c Coacervate αS/pLK (rasio molar 1:10) dina 25 µM (1 µM AF488-dilabélan αS atanapi pLK anu dilabélan Atto647N pikeun pencitraan WF) dina panyangga LLPS (luhureun) atanapi ditambahan ku 500 mM NaCl (kénca handap) atanapi saatos 10 % 1,6-héksanédiol (1,6-HD; katuhu handap).Skala bar = 20 µm.d Gambar mikroskopis ngawakilan BF droplet fusi αS / pLK (rasio molar 1:10) dina konsentrasi 25 μM;panah nunjukkeun merging tina tetes individu (panah beureum jeung konéng) kana serelek anyar (panah oranyeu) dina 200 ms).Skala bar = 20 µm.e Paburencay cahaya (dina 350 nm) αS/pLK aggregation dina panyangga LLPS saméméh jeung sanggeus tambahan 500 mM NaCl atawa 10% 1,6-HD dina 25 µM αS (N = 3 ulangan sampel, mean jeung simpangan baku ogé dituduhkeun).f Gambar BF (luhureun) jeung analisis scattering lampu (dina 350 nm, handap) tina αS / pLK aggregation dina 25 μM αS kalawan ngaronjatna αS: rasio molar pLK (N = 3 ulangan sampel, mean jeung simpangan baku ogé dituduhkeun).Skala bar = 10 µm.Bar skala dina hiji gambar nunjukkeun skala sadaya gambar dina hiji panel.Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
Dumasar observasi kami ngeunaan kondensasi kompléks éléktrostatik αS / pLK sarta observasi saméméhna tina αS salaku molekul klien tina kondensat tau / RNA ngaliwatan interaksi langsung jeung tau31, kami hipotésis yén αS na tau bisa co-segregate kalawan pangleyur dina henteuna RNA. kondensasi.ngaliwatan kompléx éléktrostatik, sarta αS nyaéta protéin scaffold dina coacervates αS/Tau (tingali distribusi muatan tau dina Gambar 2e).Kami niténan yén nalika 10 μM αS sareng 10 μM Tau441 (ngandung 1 μM AF488-αS sareng 1 μM Atto647N-Tau, masing-masing) dicampur dina panyangga LLPS, aranjeunna gampang ngabentuk agrégat protéin anu ngandung duanana protéin, sapertos anu katingali ku mikroskop WF.(Gbr. 2a).Kolokalisasi dua protéin dina titik-titik ieu dikonfirmasi ku mikroskop confocal (CF) (Suplemén Gbr. 1a).Paripolah anu sami dititénan nalika dextran-70 dianggo salaku agén agrégasi (Suplemén Gbr. 1c).Nganggo PEG atanapi dextran anu dilabélan FITC, kami mendakan yén duanana agén crowding disebarkeun merata dina sampel, henteu nunjukkeun segregasi atanapi asosiasi (Suplemén Gbr. 1d).Sabalikna, éta nunjukkeun yén dina sistem ieu aranjeunna ngamajukeun pamisahan fase ngaliwatan épék crowding makromolekul, sabab PEG mangrupikeun agén crowding anu langkung milih stabil, sapertos katingal dina sistem LLP anu sanés33,34.Titik-titik anu beunghar protéin ieu sénsitip kana NaCl (1 M) tapi henteu 1,6-HD (10% v / v), mastikeun sipat éléktrostatikna (Suplemén Gbr. 2a, b).paripolah cairan maranéhanana dikonfirmasi ku observasi millisecond merging acara droplet maké mikroskop BF (Gbr. 2b).
Gambar mikroskop Confocal (CF) tina αS / Tau441 coacervates dina panyangga LLPS (10 μM unggal protéin, 0.5 μM tina AF488-dilabélan αS sareng Atto647N-dilabélan Tau441).b Representative differential interference contrast (DIC) gambar tina αS / Tau441 droplet fusion acara (10 μM pikeun tiap protéin).c Diagram fase dumasar kana hamburan cahaya (dina 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) dina henteuna (kénca) atawa ayana (katuhu) 50 µM αS.Warna warmer nunjukkeun leuwih scattering.d Paburencay cahaya sampel αS/Tau441 LLPS kalawan ngaronjatna konsentrasi αS (Tau441 dina 5 µM, N = 2-3 ulangan sampel sakumaha dituduhkeun).e Répréséntasi skéma tina sababaraha varian protéin tau jeung wewengkon béda protéin dipaké dina ulikan ieu: muatan négatip N-terminal domain (beureum), proline-euyeub wewengkon (biru), microtubule-mengikat domain (MTBD, disorot dina jeruk), jeung spiral pasangan pembentuk amyloid.wewengkon filamén (PHF) ayana dina MTBD (abu).Peta Net Charge Per Residue (NCPR) Tau441 ditampilkeun.f Nganggo 1 µM AF488-dilabélan αS sareng Atto647N-dilabélan ΔNt-, ngagunakeun 1 µM AF488-dilabélan αS atanapi ΔCt-αS ku ayana ΔNt-Tau (luhureun, 10 µM per protéin) atanapi K18 (handap, 50 µM ) ) ) micrographs of WF condensed dina LLPS atanapi K18 panyangga.Bar skala dina hiji gambar ngagambarkeun skala sadaya gambar dina hiji panel (20 µm pikeun panel a, b jeung f).Data atah pikeun panel c jeung d disadiakeun salaku file data atah.
Pikeun nguji peran αS dina prosés LLPS ieu, urang mimiti nalungtik pangaruh αS dina stabilitas droplet ku nephelometry ngagunakeun ngaronjatna konsentrasi NaCl (Gbr. 2c).Nu leuwih luhur konsentrasi uyah dina sampel nu ngandung αS, nu leuwih luhur nilai scattering cahaya (dina 350 nm), nu nunjukkeun peran stabilisasi αS dina sistem LLPS ieu.Pangaruh anu sami tiasa dititénan ku cara ningkatkeun konsentrasi αS (sareng ku kituna rasio αS:Tau441) dugi ka kirang langkung.Kanaékan 10-fold relatif ka konsentrasi tau (5 µM) (Gbr. 2d).Pikeun nunjukkeun yén αS mangrupikeun protéin scaffold dina coacervates, kami mutuskeun pikeun nalungtik paripolah mutan Tau anu kaganggu LLPS, anu henteu ngagaduhan daérah terminal N-négatip (résé 1-150, tingali Gbr. 2e) disebut ΔNt-Tau.Mikroskopi WF sareng nephelometry dikonfirmasi yén ΔNt-Tau sorangan henteu ngalaman LLPS (Gbr. 2f sareng Gbr. Tambahan 2d), sakumaha dilaporkeun saméméhna 14. Sanajan kitu, nalika αS ditambahkeun kana solusi dispersi tina varian Tau truncated ieu, prosés LLPS lengkep. dibalikeun deui kalayan dénsitas tetesan caket sareng dénsitas tetesan solusi ukuran pinuh Tau sareng αS dina kaayaan sareng konsentrasi protéin anu sami.Prosés ieu ogé bisa dititénan dina kaayaan crowding macromolecular low (Suplemén Gbr. 2c).Peran wewengkon C-terminal αS, tapi teu sakabéh panjangna, dina prosés LLPS ieu nunjukkeun ku inhibisi formasi droplet ngagunakeun C-terminal truncated varian αS kurang résidu 104-140 (Gbr. 1a) tina (ΔCt- αS) protéin (Gbr. 2f jeung Gbr. 2d Tambahan).Kolokalisasi αS sareng ΔNt-Tau dikonfirmasi ku mikroskop fluoresensi confocal (Suplemén Gbr. 1b).
Pikeun nguji deui mékanisme LLPS antara Tau441 sareng αS, digunakeun varian Tau tambahan, nyaéta fragmen inti filamén hélik (PHF) anu dipasangkeun dina domain microtubule-binding (MTBD), anu upami ngandung opat domain ulangan karakteristik, umumna ogé dikenal. salaku sempalan K18 (tingali Gbr. 2e).Ieu nembe dilaporkeun yén αS preferentially ngiket protéin tau lokasina di domain-euyeub prolin dina urutan nu miheulaan domain microtubule-mengikat.Sanajan kitu, wewengkon PHF ogé beunghar résidu muatan positif (tingali Gambar 2e), utamana lisin (15% résidu), nu ngajurung urang pikeun nguji naha wewengkon ieu ogé nyumbang kana kondensasi αS / Tau kompléks.Kami ningali yén K18 nyalira henteu tiasa memicu LLPS dina konsentrasi dugi ka 100 μM dina kaayaan anu diuji (LLPS panyangga sareng 15% PEG atanapi 20% dextran) (Gambar 2f).Najan kitu, nalika urang ditambahkeun 50 µM αS kana 50 µM K18, formasi gancang tina ogé titik-titik protéin ngandung K18 jeung αS dititénan ku nephelometry (Supplementary Gbr. 2d) jeung WF mikroskop (Gbr. 2f).Saperti nu diharapkeun, ΔCt-αS teu bisa mulangkeun kabiasaan LLPS of K18 (Gbr. 2f).Urang dicatet yén agrégasi αS/K18 merlukeun konsentrasi protéin rada luhur pikeun ngainduksi LLPS dibandingkeun jeung αS/ΔNt-Tau atawa αS/Tau441, hal séjén anu sarua.Ieu konsisten jeung interaksi kuat wewengkon αS C-terminal jeung domain Tau-euyeub prolin dibandingkeun jeung domain microtubule-mengikat, sakumaha ditétélakeun saméméhna 31.
Kusabab ΔNt-Tau teu tiasa ngalakukeun LLPS upami henteuna αS, kami milih varian Tau ieu salaku modél pikeun ngacirian αS / Tau LLPS kumargi kesederhanaan na dina sistem LLPS sareng Tau panjang pinuh (isotype, Tau441 / Tau441).kalawan kompléks (heterotypic, αS / Tau441) prosés aggregation.Kami ngabandingkeun darajat agrégasi αS (salaku bagian tina protéin fase kentel, fαS, c) dina sistem αS / Tau sareng αS / ΔNt-Tau ku sentrifugasi sareng analisis SDS-PAGE fase dispersed (tingali 2e), mendakan nilai anu sami. pikeun sakabéh protéin dina konsentrasi sarua.Khususna, urang nampi fαS,c 84 ± 2% sareng 79 ± 7% pikeun αS / Tau sareng αS / ΔNt-Tau masing-masing, nunjukkeun yén interaksi hétérotipik antara αS sareng tau langkung unggul tibatan interaksi antara molekul tau.antawis.
Interaksi jeung rupa polycations sarta pangaruh prosés kondensasi dina kinétika αS munggaran diulik ku recovery fluoresensi sanggeus photobleaching (FRAP) métode.Kami nguji αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau sareng αS / pLK coacervates (100 μM αS ditambah ku 2 μM αS AF488-αS sareng 100 μM Tau441 atanapi ΔNt-Tau atanapi 1 mM pLK).Data dicandak dina 30 menit munggaran saatos nyampur komponén sampel.Ti gambar FRAP wawakil (Gbr. 3a, αS / Tau441 kondensasi) jeung kurva tangtu waktu saluyu maranéhanana (Gbr. 3b, Suplemén Gbr. 3), bisa ditempo yén kinétika αS pisan sarupa pamadegan Tau441 coacervates.sareng ΔNt-Tau, anu langkung gancang kalayan pLK.Koéfisién difusi diitung pikeun αS di jero coacervate numutkeun FRAP (sakumaha anu dijelaskeun ku Kang et al. 35) nyaéta D = 0,013 ± 0,009 µm2 / s sareng D = 0,026 ± 0,008 µm2 / s pikeun αS / TauS / s pikeun αS / TauS441 sistem αS/.pLK, Tau, jeung D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, masing-masing (Gbr. 3c).Sanajan kitu, koefisien difusi αS dina fase dispersed sababaraha ordo gedena leuwih luhur ti sakabeh fase condensed, sakumaha ditangtukeun ku Fluoresensi Korelasi Spéktroskopi (FCS, tingali Suplemén Gbr. 3) dina kaayaan anu sarua (LLPS panyangga) tapi dina henteuna polycations. (D = 8 ± 4 µm2/s).Ku alatan éta, kinétika tarjamah αS nyata ngurangan di coacervates dibandingkeun protéin dina fase dispersed alatan éfék crowding molekular diucapkan, sanajan sakabeh coacervates nahan sipat cair salila satengah jam kahiji sanggeus kabentukna, kontras jeung fase tau.kinétik gancang dina kondensat pLK.
a-c FRAP analisis dinamika αS (2% AF488-dilabélan αS) dina coacervates éléktrostatik.Gambar wawakil αS / Tau441 FRAP assays dina triplicate ditémbongkeun dina (a), dimana bunderan beureum nunjukkeun wewengkon decolorized.Skala bar nyaéta 5 µm.b Rata-rata kurva FRAP jeung (c) diitung koefisien difusi (D) pikeun 5-6 (N) titik-titik béda ti tilu percobaan ngagunakeun 100 µM αS jeung konsentrasi equimolar Tau441 (beureum) atawa ΔNt-Tau (biru) atawa pLK (héjo) dina sapuluh kali konsentrasi LLPS.Simpangan baku tina kurva FRAP ditémbongkeun dina warna shaded.Pikeun babandingan, koefisien difusi αS dina fase dispersed ditangtukeun dina triplicate ngagunakeun fluoresensi korelasi spéktroskopi (FCS) (tingali Suplemén Gambar 3 jeung métode pikeun émbaran leuwih lengkep).d Continuous X-band EPR spéktra 100 μM TEMPOL-122-αS dina panyangga LLPS tanpa polycation (hideung) atanapi ku ayana 100 μM Tau441 (beureum) atanapi ΔNt-Tau (biru) atanapi 1 mM pLK (héjo).Inset nembongkeun pintonan magnified tina garis widang kuat dimana parobahan paling dramatis lumangsung.e Kurva beungkeutan 50 μM TEMPOL-122-αS kalawan rupa polycations dina henteuna LLPS (euweuh PEG).Ngurangan amplitudo pita III dibandingkeun sareng pita II (IIII/III) spéktrum EPR anu dinormalisasi ditingalikeun ningkatkeun babandingan molar Tau441 (beureum), ΔNt-Tau (biru) sareng pLK (héjo).garis berwarna némbongkeun pas kana data ngagunakeun model mengikat kasar kalawan n situs mengikat idéntik jeung bebas dina unggal kurva.Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
Salaku pelengkap, urang nalungtik dinamika αS dina sagala rupa coacervates ngagunakeun diarahkeun spin labél (SDSL) jeung résonansi paramagnétik éléktron kontinyu (CW-EPR).Metoda ieu kabuktian mangpaat pisan dina ngalaporkeun kalenturan sareng dinamika IDP kalayan résolusi réalistis36,37,38.Pikeun tujuan ieu, kami ngawangun sésa sistein dina mutan Cys tunggal sareng nganggo usik spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Turunan maleimide labél aranjeunna.Leuwih husus, urang nyelapkeun panyilidikan TEMPOL dina posisi 122 atawa 24 αS (TEMPOL-122-αS jeung TEMPOL-24-αS).Dina kasus nu pertama, urang sasaran wewengkon C-terminal protéin, nu aub dina interaksi jeung polycations.Gantina, posisi 24 tiasa masihan urang informasi ngeunaan dinamika sakabéh protéin dina condensate nu.Dina duanana kasus, sinyal EPR diala pikeun protéin fase dispersed pakait jeung radikal nitroksida dina kaayaan pindah gancang.Saatos pamisahan fase ku ayana tau atanapi pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 atanapi ΔNt-Tau dina nisbah 1: 1 atanapi pLK dina nisbah 1:10), paningkatan dina inténsitas puncak relatif dititénan dina spéktrum EPR αS.Garis leungitna ngalegaan, nunjukkeun kinétika réorientasi αS diréduksi dina tetes dibandingkeun protéin dina fase éncér (Gbr. 3d, Gambar Tambahan 4a).Parobihan ieu langkung jelas dina posisi 122. Sedengkeun dina posisi 24 ayana pLK henteu mangaruhan kinétika usik, dina posisi 122 bentuk garis spéktral robah sacara signifikan (Suplemén Gbr. 4a).Nalika urang nyobian model spéktra dina posisi 122 dua sistem αS / polycation ngagunakeun modél isotropic (Suplemén Gambar 5a) ilahar dipaké pikeun ngajelaskeun dinamika spin-dilabélan IDP38,39, urang teu bisa ngarekonstruksikeun spéktra eksperimen..simulasi spéktral tina posisi 24 spins kontras (Suplemén Gbr. 5a).Ieu nunjukkeun yén aya posisi preferensial dina spasi konfigurasi spin wewengkon C-terminal αS ku ayana polycations.Nalika nganggap fraksi αS dina fase kentel dina kaayaan EPR ékspérimén (84 ± 2%, 79 ± 7%, sareng 47 ± 4% pikeun αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, sareng αS / pLK, masing-masing-tingali Suplemén). Gbr. 2e analisis data c), bisa ditempo yén broadening nu dideteksi ku métode EPR utamana ngagambarkeun interaksi wewengkon C-terminal of αS jeung rupa polycations dina fase condensed (parobahan utama lamun ngagunakeun TEMPOL-122- αS), sanes kondensasi protéin.Paningkatan microviscosity dititénan dina usik.Saperti nu diharapkeun, spéktrum EPR protéin dina kaayaan lian ti LLPS lengkep disimpen nalika 1 M NaCl ditambahkeun kana campuran (Suplemén Gbr. 4b).Gemblengna, data urang nunjukkeun yén parobahan nu dideteksi ku CW-EPR utamana ngagambarkeun interaksi wewengkon C-terminal αS kalawan rupa polycations dina fase condensed, sarta interaksi ieu sigana kuat kalawan pLK ti kalawan Tau.
Pikeun kéngingkeun inpormasi struktural langkung seueur ngeunaan protéin dina coacervate, kami mutuskeun pikeun diajar sistem LLPS nganggo NMR dina solusi.Najan kitu, urang ngan bisa ngadeteksi fraksi αS sésana dina fase dispersed, nu bisa jadi alatan dinamika protéin ngurangan di jero coacervate jeung fase padet di handapeun solusi dina analisis NMR.Nalika kami nganalisis struktur sareng dinamika protéin anu sésana dina fase dispersed tina sampel LLPS nganggo NMR (Suplemén Gbr. 5c, d), kami perhatikeun yén protéinna kalakuanana ampir idéntik dina ayana pLK sareng ΔNt-Tau, duanana nu aya dina struktur sekundér jeung dinamika tulang tonggong protéin, wangsit ku percobaan dina shift kimiawi sekundér jeung rélaxasi R1ρ.Data NMR nunjukkeun yén C-terminus αS kaleungitan fleksibilitas konformasi anu signifikan bari nahan sifat karusuhan na, sapertos sesa sekuen protéin, kusabab interaksina sareng polikasi.
Kusabab broadening sinyal CW-EPR dititénan dina fase condensed TEMPOL-122-αS ngagambarkeun interaksi protéin jeung polycations, urang ngalakukeun hiji titration EPR pikeun evaluate afinitas mengikat αS kana rupa polycations dina henteuna LLPS (euweuh akumulasi Panyangga LLPS), nunjukkeun yén interaksina sami dina fase éncér sareng kentel (anu dikonfirmasi ku data urang, Suplemén Gbr. 4a sareng Suplemén Gbr. 6).Tujuanana nyaéta pikeun ningali naha sadaya coacervates, sanaos sipat sapertos cairan umumna, nunjukkeun kabiasaan diferensial anu aya dina tingkat molekular.Saperti nu diharapkeun, spéktrum EPR ngalegaan kalawan ngaronjatna konsentrasi polycation, reflecting panurunan dina kalenturan molekular alatan interaksi molekular sadaya mitra interaksi ampir jenuh (Gbr. 3e, Suplemén Gbr. 6).pLK ngahontal jenuh ieu dina babandingan molar handap (polycation: αS) dibandingkeun ΔNt-Tau na Tau441.Nyatana, ngabandingkeun data sareng modél beungkeut perkiraan anu nganggap n situs beungkeutan idéntik sareng mandiri nunjukkeun yén konstanta disosiasi pLK (~ 5 μM) mangrupikeun tatanan gedéna langkung handap tina Tau441 atanapi ΔNt-Tau (~ 50 μM. ).µM).Sanaos ieu perkiraan kasar, ieu nunjukkeun yén αS gaduh afinitas anu langkung luhur pikeun polikasi anu langkung sederhana sareng daérah muatan positif anu terus-terusan.Dibikeun bédana ieu dina pangirut antara αS sareng rupa-rupa polycations, kami hipotésis yén sipat cairna tiasa robih béda dina waktosna sahingga ngalaman prosés LSPT anu béda.
Dibikeun lingkungan anu rame pisan dina protéin coacervate sareng sifat amyloid protéin, kami niténan paripolah coacervate kana waktosna pikeun ngadeteksi prosés LSPT anu mungkin.Ngagunakeun mikroskop BF jeung CF (Gambar 4), urang katalungtik yén αS / Tau441 coacervates ka extent badag dina leyuran, ngabentuk ogé titik-titik badag nu kontak jeung baseuh beungeut di handapeun sumur / slide sakumaha ogé titik-titik pinuh, saperti nu diharapkeun (Suplemén Gbr. 7d);Urang nelepon struktur handap-kabentuk ieu "rakit protéin".Struktur ieu tetep cairan sabab dipikagaduh kamampuhan pikeun ngahiji (Suplemén Gbr. 7b) jeung bisa ditempo pikeun sababaraha jam sanggeus LLPS ieu dipicu (Gbr. 4 jeung Suplemén Gbr. 7c).Urang katalungtik yén prosés wetting ieu favored dina beungeut hidrofilik tinimbang bahan hidrofobik (Suplemén Gbr. 7a), saperti nu diharapkeun pikeun coacervates éléktrostatik kalawan muatan henteu saimbang sahingga poténsi permukaan éléktrostatik tinggi.Utamana, coalescence αS / ΔNt-Tau sareng arung jeram dikirangan sacara signifikan, sedengkeun kondensat αS / pLK ngirangan sacara signifikan (Gbr. 4).Dina waktos inkubasi pondok, titik-titik αS / pLK tiasa ngahiji sareng ngabaseuhan permukaan hidrofilik, tapi prosés ieu gancang dieureunkeun sareng saatos 5 jam inkubasi, ngan ukur kajadian coalescence kawates sareng teu aya wetting anu ditingali.- transisi gél-tetesan.
Perwakilan BF (panél abu-abu) sareng CF (panél katuhu, AF488-dilabélan αS dina warna héjo) tina conto coacervate ngandung 100 µM αS (1% labél fluoresensi) dina panyangga LLPS ku ayana 100 µM Tau441 (luhureun) gambar fluoresensi) mikroskopis -Tau (tengah) atanapi 1 mM pLK (handap) dina kali inkubasi béda jeung jangkungna fokus (z, jarak ti handap piring ogé).Percobaan diulang 4-6 kali sacara mandiri sareng hasil anu sami.Coacervates αS/Tau441 dibasahan saatos 24 jam, ngabentuk rakit anu langkung ageung tibatan gambar.Bar skala pikeun sakabéh gambar nyaéta 20 µm.
Kami teras naroskeun naha kolam renang protéin sapertos cairan ageung kabentuk dina αS / Tau441 LLPS bakal ngakibatkeun agrégasi amiloid tina salah sahiji protéin anu ditaliti.Urang nuturkeun maturation of αS / Tau441 ogé titik-titik kana waktu jeung mikroskop WF dina kaayaan anu sarua sakumaha di luhur, tapi ngagunakeun 1 μM AF488-dilabélan αS jeung Atto647N-dilabélan Tau441 (Gbr. 5a).Sapertos anu dipiharep, urang ningali lokalisasi protéin lengkep sapanjang prosés maturasi.Narikna, ti ca.Saatos 5 jam, struktur non-sirkular anu langkung sengit dititénan di jero rakit, anu kami disebut "titik", sababaraha anu dikolokalkeun ku αS, sareng sababaraha anu diperkaya dina Tau441 (Gbr. 5a, panah bodas).Bintik-bintik ieu sok dititénan dina rakit pikeun αS/ΔNt-Tau langkung ageung tibatan αS/ΔNt-Tau.Henteu aya bintik-bintik anu béda dina titik-titik pLK sareng sistem Tau anu henteu mampuh pikeun fusi / baseuh.Pikeun nguji naha noda ieu ngandung αS sareng Tau441 mangrupikeun agrégat sapertos amiloid, kami ngalaksanakeun percobaan anu sami nganggo mikroskop CF dimana Tau441 dilabélan ku Atto647N sareng 12.5 μM amyloid-spésifik thioflavin-T (ThT) ditambahkeun ti mimiti.ngawarnaan.Sanajan ThT-staining of αS / Tau441 ogé titik-titik atawa rakit teu katalungtik malah sanggeus 24 h inkubasi (Gbr. 5b, baris luhur-tetesan sésana leuwih rakit protéin), struktur ThT-positip ngandung Atto647N-Tau441 jero rakit lemah pisan.ieu réplikasi ukuran, bentuk, jeung lokasi bintik ditétélakeun saméméhna (Gbr. 5b, baris tengah jeung handap), nunjukkeun yen bintik bisa pakait jeung agrégat amyloid-kawas kabentuk dina coacervates cairan sepuh.
WF 25 μM αS dina sababaraha waktos inkubasi sareng jangkungna fokus (z, jarak ti handap henteu kabeungkeut) ku ayana 25 μM Tau441 (1 μM AF488-dilabélan αS sareng Atto647N-dilabélan Tau441) dina sumur tina piring mikroskop sareng panyangga LLPS) .Genep percobaan diulang sacara mandiri kalayan hasil anu sami.b Gambar mikroskopis CF 25 μM αS ku ayana 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-dilabélan Tau441) jeung 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Titisan protéin anu ditimbang sareng rakit sareng bintik protéin anu disimpen ditingalikeun masing-masing dina barisan luhur sareng tengah.Baris handap nembongkeun gambar rakit jeung tetes ti 3 ulang bebas.Panah bodas nunjukkeun titik-titik ThT-positip dina duanana panel.Bar skala pikeun sakabéh gambar nyaéta 20 µm.
Pikeun mariksa langkung rinci parobahan dina jaringan protéin coacervate salami transisi tina cair ka padet, kami nganggo pencitraan umur fluoresensi (FLIM) sareng mikroskop transfer énergi résonansi Förster (FRET) (Gambar 6 sareng Gambar Tambahan 8 sareng 9).Urang hipotésis yén maturation coacervate tina lapisan kana struktur protéin aggregated leuwih condensed atawa malah padet-kawas ngabalukarkeun kontak ngadeukeutan antara protéin jeung usik fluoresensi napel na, berpotensi ngahasilkeun éfék quenching manifested dina hirupna usik disingget (τ) , sakumaha ditétélakeun saméméhna40.,41,42.Salaku tambahan, pikeun sampel anu dilabélan ganda (AF488 sareng Atto647N masing-masing salaku donor FRET sareng pewarna akséptor), panurunan τ ieu ogé tiasa dibarengan ku kondensasi coacervate sareng paningkatan efisiensi FRET (E) salami LSPT.Kami ngawaskeun rakit sareng formasi titik dina waktosna dina conto LLPS αS / Tau441 sareng αS / ΔNt-Tau (25 µM unggal protéin dina panyangga LLPS anu ngandung 1 µM AF488 dilabélan αS sareng / atanapi Atto647N dilabélan Tau441 atanapi ΔNt-Tau).Kami niténan tren umum yén umur fluoresensi AF488 (τ488) sareng panyilidikan Atto647N (τ647N) rada turun nalika coacervates matured (Gbr. 6 sareng Gbr. 8c).Narikna, parobahan ieu sacara signifikan ditingkatkeun pikeun titik-titik dina rakit (Gbr. 6c), nunjukkeun yén kondensasi protéin salajengna lumangsung dina titik-titik.Pikeun ngadukung ieu, teu aya parobahan anu signifikan dina umur fluoresensi anu dititénan pikeun tetesan αS / ΔNt-Tau umurna pikeun 24 h (Suplemén Gbr. 8d), nunjukkeun yén gelation tetesan mangrupikeun prosés anu béda ti spotting sareng anu henteu dibarengan ku reorganisasi molekular anu signifikan. dina coacervates.Ieu kudu dicatet yén titik-titik boga ukuran béda jeung eusi variabel dina αS, hususna keur sistem αS / Tau441 (Suplemén Gbr. 8e).Turunna umur fluoresensi titik ieu dibarengan ku paningkatan inténsitas, khususna pikeun Atto647N dilabélan Tau441 (Suplemén Gbr. 8a), sareng efisiensi FRET anu langkung luhur pikeun sistem αS / Tau441 sareng αS / ΔNt-Tau, nunjukkeun kondensasi salajengna dina LLPS Lima jam. sanggeus triggering, protéin di jero listrik statik condensed.Dibandingkeun sareng αS/ΔNt-Tau, urang niténan nilai τ647N anu langkung handap sareng nilai τ488 anu rada luhur dina bintik αS/Tau441, dipirig ku nilai FRET anu langkung handap sareng henteu homogen.Panginten, ieu tiasa aya hubunganana sareng kanyataan yén dina sistem αS / Tau441, kalimpahan αS anu dititénan sareng diperkirakeun dina agrégat langkung hétérogén, sering substoichiometric dibandingkeun Tau, sabab Tau441 sorangan ogé tiasa ngalaman LLPS sareng agrégasi (Suplemén Gbr. 8e) .Sanajan kitu, darajat coalescence tetesan, formasi rakit, jeung, importantly, aggregation protéin dina coacervates cair-kawas maksimal lamun duanana Tau441 jeung αS hadir.
Gambar mikroskopi fluoresensi hirup (FLIM) tina αS / Tau441 sareng αS / ΔNt-Tau dina 25 μM unggal protéin (1 μM AF488-dilabélan αS sareng 1 μM Atto647N-dilabélan Tau441 atanapi ΔNt-Tau) dina panyangga LLPS.Kolom nunjukkeun gambar wawakil sampel LLPS dina waktos maturation anu béda (30 mnt, 5 jam sareng 24 jam).Pigura beureum nembongkeun wewengkon nu ngandung bintik αS/Tau441.Rentang hirup ditémbongkeun salaku bar warna.Skala bar = 20 µm pikeun sakabéh gambar.b Gambar FLIM dizum-in wewengkon nu dipilih, ditémbongkeun dina kotak beureum dina panel a.Rentang hirup ditingalikeun nganggo skala warna anu sami sareng dina panel a.Skala bar = 5 µm.c Histogram némbongkeun AF488 (napel αS) atawa Atto647N (napel Tau) pikeun spésiés protéin béda (titisan-D-, rakit-R- jeung speckle-P) dicirikeun dina gambar FLIM dirékam pikeun αS-) sebaran timing hirupna Tau441 jeung αS / ΔNt-Tau sampel coacervate (N = 17-32 ROI pikeun D, ​​29-44 ROI pikeun R, sarta 21-51 ROI pikeun titik).Nilai rata-rata sareng median ditingalikeun salaku kotak konéng sareng garis hideung di jero kotak, masing-masing.Wates handap jeung luhur kotak ngagambarkeun kuartil kahiji jeung katilu, masing-masing, sarta nilai minimum jeung maksimum dina rentang interquartile 1,5-melu (IQR) ditémbongkeun salaku kumis.Outliers ditémbongkeun salaku inten hideung.Signifikansi statistik antara pasangan distribusi ditangtukeun ngagunakeun t-test dua sampel, asumsina varian unequal.Dua-buntut t-test p-values ​​ditémbongkeun kalawan tanda bintang pikeun tiap pasangan data dibandingkeun (* p-value > 0,01, ** p-value > 0,001, *** p-value > 0,0001, **** p-nilai> 0,00001), ns Nunjukkeun negligibility (p-nilai> 0,05).Nilai p anu pasti dirumuskeun dina Tabél Tambahan 1, sareng data asli dibere salaku file data atah.
Pikeun langkung nunjukkeun sipat bintik / agrégat sapertos amiloid, kami ngarawat conto coacervate anu teu diwarnaan salami 24 jam kalayan konsentrasi luhur (1 M) NaCl, anu nyababkeun pamisahan agrégat tina coacervates protéin.Nalika agrégat terasing (nyaéta, larutan agrégat anu kasebar) dititénan ngagunakeun mikroskop gaya atom (AFM), urang niténan morfologi anu utamana buleud kalayan jangkungna biasa kira-kira 15 nm, anu condong pakait dina kaayaan konsentrasi uyah anu luhur, sarupa jeung paripolah fibrils amyloid has alatan éfék hidrofobik kuat dina beungeut cai (perhatikeun yén fibrils ilaharna boga jangkungna ~ 10 nm) (Suplemén Gbr. 10a).Narikna, nalika agrégat terasing diinkubasi sareng ThT dina assay fluoresensi ThT standar, kami ningali paningkatan dramatis dina ngahasilkeun kuantum fluoresensi ThT, dibandingkeun sareng anu dititénan nalika ngalelep diinkubasi sareng fibrils amyloid αS khas (Suplemén Gbr. 10b), nunjukkeun yén. agrégat coacervate ngandung struktur kawas amyloid..Kanyataanna, aggregates éta toleran kana konsentrasi uyah tinggi tapi sénsitip kana 4 M guanidine klorida (GdnHCl), kawas fibrils amyloid has (Suplemén Gbr. 10c).
Salajengna, urang nganalisa komposisi agrégat ngagunakeun fluoresensi molekul tunggal, korelasi fluoresensi spéktroskopi / cross-correlation spéktroskopi (FCS / FCCS), sareng analisis burst tina deteksi kabeneran dua warna (TCCD).Pikeun tujuan ieu, kami ngasingkeun agrégat kabentuk saatos 24 jam inkubasi dina 100 μl LLPS conto anu ngandung αS sareng Tau441 (duanana 25 μM) sareng 1 μM AF488-dilabélan αS sareng 1 μM Atto647N-dilabélan Tau441.Éncér leyuran agrégat kasebar nu dihasilkeun kana kaayaan monomolekul maké panyangga bébas PEG sarua jeung 1 M NaCl (panyangga sarua dipaké pikeun misahkeun agrégat ti coacervate) pikeun nyegah sagala kamungkinan interaksi éléktrostatik antara LLPS jeung protéin.Conto lintasan waktu molekul tunggal bisa ditempo dina Gbr. 7a.Analisis FCCS / FCS (korelasi silang, CC sareng autokorelasi, AC) nunjukkeun yén agrégat anu ngandung αS sareng tau seueur pisan dina conto (tingali kurva CC dina Gbr. 7b, panel kénca), sareng kaleuwihan protéin monomérik sésa timbul salaku a hasil tina prosés éncér (tingali kurva AC dina Gambar 7b, panel kénca).Ékspérimén kontrol anu dilakukeun dina kaayaan solusi anu sami nganggo conto anu ngan ukur ngandung protéin monomérik henteu nunjukkeun kurva CC, sareng kurva AC pas sareng modél difusi hiji-komponén (Persamaan 4), dimana protéin monomérik ngagaduhan koefisien difusi anu diperkirakeun (Gbr. 7b). ), panel katuhu).Koéfisién difusi partikel agrégat kurang ti 1 µm2/s, jeung protéin monomér kira-kira 1 µm2/s.50–100 µm/s;nilai nu sarupa jeung nilai diterbitkeun saméméhna pikeun sonicated αS amyloid fibrils na monomeric αS misah dina kaayaan solusi sarupa44.Nalika kami nganalisis agrégat kalayan analisis ledakan TCCD (Gbr. 7c, panel luhur), kami mendakan yén dina unggal agrégat terasing (αS / Tau heteroaggregate), sakitar 60% tina agrégat anu dideteksi ngandung duanana αS sareng tau, sakitar 30% ngan ukur ngandung tau, ngeunaan 10% αS wungkul.Analisis Stoichiometric of αS / Tau heteroaggregates némbongkeun yén lolobana heteroaggregates anu enriched di tau (stoichiometry handap 0.5, jumlah rata-rata molekul tau per agrégat téh 4 kali leuwih ti molekul αS), nu konsisten jeung karya urang observasi dina FLIM in situ. percobaan..Analisis FRET nunjukkeun yén agrégat ieu ngandung duanana protéin, sanaos nilai FRET saleresna dina hal ieu henteu penting pisan, sabab distribusi fluorofor dina unggal agrégat sacara acak kusabab kaleuwihan protéin anu teu dilabélan anu dianggo dina percobaan.Narikna, nalika urang ngalakukeun analisa anu sami nganggo 45,46 amiloid dewasa aggregation-kakurangan varian Tau (tingali Suplemén Gbr. 11a, b), kami perhatikeun yén sanajan agrégasi éléktrostatik αS sami (Suplemén Gbr. 11c, d), kamampuhan pikeun ngabentuk aggregates dina coacervate ieu drastis ngurangan tur FLIM kauninga sababaraha spot dina percobaan in situ, sarta kurva cross-korelasi lemah anu observasi pikeun sampel agrégat terasing.Najan kitu, pikeun sajumlah leutik agrégat nu dideteksi (ngan hiji kasapuluh tina Tau441), kami niténan yén unggal agrégat ieu enriched di αS ti varian Tau ieu, kalawan kurang leuwih 50% tina agrégat nu dideteksi ngan ngandung molekul αS, sarta αS éta hétérogén dina kaleuwihan. .agrégat (tingali Suplemén Gbr. 11e), kontras jeung agrégat hétérogén dihasilkeun Tau441 (Gbr. 6f).Hasil tina percobaan ieu némbongkeun yén sanajan αS sorangan sanggup ngumpulkeun jeung tau dina coacervate, nukléasi tau leuwih nguntungkeun dina kaayaan ieu, sarta hasilna agrégat amiloid-kawas bisa meta salaku wangun αS jeung tau.Sanajan kitu, sakali inti-euyeub tau kabentuk, interaksi hétérotipik antara αS jeung tau nu favored di aggregates leuwih interaksi homotypic antara molekul tau;urang ogé niténan jaringan protéin dina cair αS / tau coacervates.
a Perwakilan fluoresensi ngambah temporal molekul tunggal aggregates terasing kabentuk dina αS / Tau441 coacervates éléktrostatik.Bursts pakait jeung αS / Tau441 coaggregates (bursts luhureun bangbarung nu dituduhkeun) dititénan dina tilu saluran deteksi (AF488 na Atto647N émisi sanggeus éksitasi langsung, garis biru jeung beureum, Atto647N émisi sanggeus éksitasi teu langsung), FRET, garis Violet).b Analisis FCS/FCCS tina sampel agrégat αS/Tau441 terasing diala tina LLPS (panel kénca).Kurva autokorelasi (AC) pikeun AF488 sareng Atto647N masing-masing dipidangkeun dina warna biru sareng beureum, sareng kurva korelasi silang (CC) anu aya hubunganana sareng agrégat anu ngandung duanana pewarna dipidangkeun dina warna ungu.Kurva AC ngagambarkeun ayana spésiés protéin monomérik sareng agrégat anu dilabélan, sedengkeun kurva CC ngan ukur nunjukkeun difusi agrégat anu dilabélan ganda.Analisa anu sami, tapi dina kaayaan solusi anu sami sareng bintik terasing, conto anu ngan ukur ngandung αS monomér sareng Tau441 ditingalikeun salaku kadali dina panel katuhu.c Analisis lampu kilat fluoresensi molekul tunggal agrégat terasing kabentuk dina coacervates éléktrostatik αS/Tau441.Émbaran pikeun tiap agrégat kapanggih dina opat ulang béda (N = 152) anu plotted ngalawan stoichiometry maranéhanana, nilai S, sarta efisiensi FRET (panel luhur, bar warna ngagambarkeun kajadian).Tilu jinis agrégat tiasa dibédakeun: -αS-hijina agrégat kalayan S~1 sareng FRET~0, Tau-hijina agrégat kalayan S~0 sareng FRET~1, sareng hétérogén Tau/αS agrégat kalayan S~1 sareng FRET Perkiraan jumlahna duanana protéin spidol kauninga dina unggal agrégat hétérogén (N = 100) ditémbongkeun dina panel handap (skala warna ngagambarkeun kajadian).Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
The maturation atanapi sepuh protéin cair condensates kana gél-kawas atanapi struktur padet kana waktu geus dilaporkeun ka aub dina sababaraha fungsi fisiologis condensate47 ogé dina kasakit, salaku prosés abnormal saméméh aggregation amyloid 7, 48, 49. Ieuh. urang diajar separation fase jeung kabiasaan di jéntré.LSPT αS ku ayana polycations acak dina lingkungan dikawasa dina konsentrasi micromolar low jeung kaayaan fisiologis relevan (perhatikeun yén diitung konsentrasi fisiologis αS nyaeta> 1 µM50), nuturkeun kabiasaan thermodynamically disetir has LPS.Kami mendakan yén αS, anu ngandung daérah terminal C anu muatanana négatif pisan dina pH fisiologis, tiasa ngabentuk titik-titik anu beunghar protéin dina leyuran cai ngalangkungan LLPS ku ayana péptida anu kaganggu pisan kationik sapertos pLK atanapi Tau ngaliwatan prosés éléktrostatik. kondensasi kompléks ku ayana makromolekul agrégat.Prosés ieu tiasa gaduh pangaruh anu relevan dina lingkungan sélulér dimana αS nepungan rupa-rupa molekul polycationic anu aya hubunganana sareng agrégasi anu aya hubunganana sareng panyakit boh in vitro sareng in vivo51,52,53,54.
Dina seueur panilitian, dinamika protéin dina tetesan dianggap salaku salah sahiji faktor konci anu nangtukeun prosés maturasi55,56.Dina αS éléktrostatik coacervates kalawan polycations, prosés maturation tétéla gumantung kana kakuatan interaksi jeung polycations, valénsi, sarta multiplicity interaksi ieu.Téori kasatimbangan nunjukkeun yén hiji bentang kasatimbangan dua kaayaan cair bakal ayana droplet badag beunghar biopolymers nu ngajalankeun LLPS57,58.Tumuwuh droplet tiasa dihontal ku maturation59 Ostwald, coalescence60 atanapi konsumsi monomér bébas dina fase dispersed61.Pikeun αS sareng Tau441, ΔNt-Tau atanapi pLK, sabagéan ageung protéin kentel dina kondensat dina kaayaan anu dianggo dina ulikan ieu.Sanajan kitu, bari tetes tau ukuran pinuh coalesced gancang kana baseuh permukaan, coalescence tetesan jeung wetting hésé pikeun ΔNt-Tau na pLK, suggesting leungitna gancang sipat cair dina dua sistem ieu.Numutkeun kana analisa FLIM-FRET kami, titisan pLK sareng ΔNt-Tau yuswa nunjukkeun tingkat agrégasi protéin anu sami (umur fluoresensi anu sami) salaku titik-titik asli, nunjukkeun yén jaringan protéin asli dipikagaduh, sanaos langkung kaku.
Urang rationalize hasil eksperimen urang dina model di handap ieu (Gambar 8).Titisan mimitina samentara kabentuk mindeng jaringan protéin tanpa santunan éléktrostatik, sahingga aya wewengkon saimbangna muatan, utamana dina panganteur droplet, hasilna ogé titik-titik kalawan poténsi permukaan éléktrostatik tinggi.Pikeun ngimbangan muatan (fenomena anu biasa disebut deplesi valénsi) sareng ngaminimalkeun poténsi permukaan titik-titik, titik-titik tiasa kalebet polipéptida énggal tina fase éncér, ngatur deui jaringan protéin pikeun ngaoptimalkeun interaksi muatan-muatan, sareng berinteraksi sareng titik-titik sanés.kalawan surfaces (wetting).Titisan αS/pLK, alatan jaringan protéinna nu leuwih basajan (ngan interaksi heterotipik antara αS jeung pLK) jeung afinitas nu leuwih gede pikeun interaksi protéin-protéin, sigana bisa nyaimbangkeun muatan kondensat nu leuwih gancang;Saleresna, urang niténan kinétika protéin anu langkung gancang dina awalna kabentuk αS / pLK coacervates ti di αS / Tau.Saatos deplesi valénsi, interaksi jadi kurang ephemeral sarta titik-titik leungit sipat cair maranéhanana sarta robah jadi gél-kawas, titik-titik non-kaduruk ku poténsi permukaan éléktrostatik low (ku kituna teu bisa baseuh beungeut cai).Sabalikna, tetesan αS/Tau kurang éfisién dina ngaoptimalkeun kasaimbangan muatan tetesan kusabab jaringan protéin anu langkung kompleks (kalayan interaksi homotypic sareng heterotypic) sareng sifat interaksi protéin anu lemah.Ieu nyababkeun titik-titik anu nahan paripolah cair pikeun période waktos anu panjang sareng nunjukkeun poténsi permukaan éléktrostatik anu luhur anu condong diminimalkeun ku ngagabung sareng ngembang (sahingga ngaminimalkeun rasio permukaan / volume tetesan) sareng ku ngabasakeun kimia permukaan hidrofilik.Ieu nyiptakeun perpustakaan protéin kentel badag nu nahan sipat cairan salaku interaksi tetep pisan fana alatan pilarian konstan pikeun optimasi muatan dina jaringan protéin.Narikna, bentuk N-terminally truncated tina Tau, kaasup sababaraha isoforms kajadian sacara alami62, némbongkeun kabiasaan panengah, kalawan sababaraha coacervates sepuh kalawan αS kana titik-titik gél-hirup lila, sedengkeun nu sejenna robah jadi condensates cair badag.Dualitas ieu dina maturasi coacervates éléktrostatik αS konsisten sareng studi téoritis sareng ékspérimén LLPS panganyarna anu parantos ngaidentipikasi korelasi antara deplesi valénsi sareng sieving éléktrostatik dina kondensat salaku konci pikeun ngadalikeun ukuran kondensat sareng sipat cairan.Mékanisme 58.61.
Skéma ieu nunjukkeun jalur agrégasi amyloid putative pikeun αS sareng Tau441 via LLPS sareng LSPT.Kalawan tambahan wewengkon-euyeub anion (beureum) jeung kation-euyeub (biru), coacervates éléktrostatik αS jeung tau kalawan valénsi nyugemakeun boga énergi permukaan handap sahingga kirang coalescence, hasilna sepuh droplets gancang.Hiji kaayaan gél non-agglomerated stabil kahontal..Kaayaan ieu nguntungkeun pisan dina kasus sistem αS / pLK kusabab pangirutna anu langkung luhur sareng jaringan interaksi pasangan protéin anu langkung sederhana, anu ngamungkinkeun transisi sapertos gél gancang.Sabalikna, titik-titik kalayan valénsi anu henteu nyugemakeun sareng, ku kituna, daérah anu dieusi protéin sayogi pikeun interaksi, ngagampangkeun coacervate ngahiji sareng ngabaseuhan permukaan hidrofilik pikeun ngirangan énergi permukaan anu luhur.Kaayaan ieu leuwih hade pikeun coacervates αS/Tau441, nu boga jaringan kompléks multivalent diwangun ku interaksi Tau-Tau jeung αS-Tau lemah.Sabalikna, coacervates gedé bakal leuwih gampang nahan sipat cairan maranéhanana, sahingga interaksi protéin-ka-protéin séjén lumangsung.Antukna, agrégat hétérogén amyloid ngandung duanana αS sareng tau ngabentuk dina cairan coacervate, anu tiasa aya hubunganana sareng anu aya dina badan inklusi, anu mangrupikeun ciri panyakit neurodegeneratif.
Struktur kawas cairan badag kabentuk salila maturation of αS / Tau441 kalawan lingkungan protéin kacida congested tapi dinamis sarta, mun extent Lesser, coacervates αS / ΔNt-Tau mangrupakeun waduk idéal pikeun nucleation tina aggregation protéin.Urang memang geus niténan formasi agrégat protéin padet dina tipe coacervates protéin ieu, mindeng ngandung duanana αS jeung tau.Kami parantos nunjukkeun yén hétéroagrégat ieu distabilkeun ku interaksi non-éléktrostatik, tiasa ngabeungkeut pewarna ThT khusus-amyloid dina cara anu sami sareng fibrils amyloid khas, sareng memang gaduh résistansi anu sami pikeun sagala rupa pangaruh.Agrégat αS/tau anu dibentuk ku LLPS katémbong miboga sipat kawas amyloid.Mémang, varian dewasa tina Tau kakurangan dina agrégasi amiloid sacara signifikan impaired dina formasi agrégat αS hétérogén ieu dina coacervate éléktrostatik cair.Kabentukna agrégat αS/Tau441 dititénan ukur di jero coacervates, nu nahan sipat kawas cair, sarta pernah, lamun coacervates/titisan teu ngahontal kaayaan gél.Dina kasus dimungkinkeun, ngaronjat kakuatan interaksi éléktrostatik jeung, salaku hasilna, rigidity jaringan protéin nyegah rearrangements konformasi diperlukeun protéin pikeun ngadegkeun interaksi protéin anyar diperlukeun pikeun nucleation amyloid.Sanajan kitu, ieu bisa dihontal dina leuwih fleksibel, coacervates cair-kawas, anu dina gilirannana leuwih gampang tetep cair sabab ngaronjatna ukuranana.
Kanyataan yén formasi agrégat dina fase condensed leuwih hade dina kondensat αS/Tau badag batan dina ogé titik-titik leutik nu gancang gél, highlights relevansi pikeun ngaidentipikasi faktor nu ngadalikeun coalescence titik.Ku kituna, teu ngan aya kacenderungan pikeun separation fase, tapi ukuran condensate nu kudu dikawasa pikeun fungsi ditangtoskeun kitu ogé prevention panyakit58,61.Hasil kami ogé nyorot pentingna kasaimbangan antara LLPS sareng LSPT pikeun sistem αS / Tau.Nalika formasi tetesan tiasa ngajagi tina agrégasi amiloid ku cara ngirangan jumlah monomér protéin anu aya dina kaayaan jenuh, sapertos anu diusulkeun dina sistem63,64 sanés, fusi tetesan dina tingkat tetesan anu luhur tiasa nyababkeun agrégasi protéin internal ngaliwatan penyusunan ulang konformasi anu laun.jaringan protéin..
Gemblengna, data urang niatna ngantebkeun relevansi valénsi cohesive sarta interaksi wareg / unsatisfied dina jaringan serelek dina konteks LSPT.Khususna, kami nunjukkeun yén kondensat αS / Tau441 panjangna tiasa sacara éfisién ngahiji sareng nukléat pikeun ngabentuk hétéroagrégat sapertos amyloid anu kalebet protéin sareng ngajukeun mékanisme molekular dumasar kana hasil ékspérimén urang.Ko-aggregasi dua protéin dina coacervate cairan αS / Tau anu kami laporkeun di dieu tiasa leres-leres aya hubunganana sareng lokalisasi dua protéin dina inklusi, anu mangrupikeun ciri khas panyakit, sareng tiasa nyumbang kana pamahaman hubungan antara LLPS sareng agrégasi amiloid, paving jalan pikeun IDP kacida muatan dina neurodegeneration.
Monomérik WT-αS, mutan sistein (Q24C-αS, N122C-αS) jeung varian ΔCt-αS (Δ101-140) dinyatakeun dina E. coli jeung dimurnikeun sakumaha ditétélakeun saméméhna.5 mM DTT ieu kaasup dina sakabéh hambalan dina purifikasi αS cysteine ​​​​mutants pikeun nyegah formasi beungkeut disulfida.Tau441 isoform (plasmid diala tina Addgene #16316), varian ΔNt-Tau (Δ1–150, diala ku kloning IVA kalawan primers CTTTAAGAAGGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) jeung AggDef-Tau varian primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC) jeung AggDef-Tau varian (1ΔTC5-Tau dimurnikeun). tumuwuh nepi ka OD600 = 0.6-0.7 dina 37 ° C jeung 180 rpm, sarta ekspresi ieu ngainduksi kalawan IPTG pikeun 3 jam dina 37 ° C.Panén sél dina 11.500 xg salila 15 mnt dina 4 °C jeung cuci jeung panyangga saline ngandung 150 mM NaCl.Resuspend pellet dina lysis panyangga (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 1000).Lengkah sonication dipigawé dina és kalawan amplitudo 80% pikeun 10 pulsa (1 mnt on, 1 mnt off).Ulah ngaleuwihan 60 ml dina hiji ultrasound.E. coli lysates dipanaskeun dina 95 ° C. salila 20 menit, lajeng leuwih tiis dina és sarta centrifuged dina 127.000 × g salila 40 menit.Supernatan anu dijelaskeun diterapkeun kana mémbran 3,5 kDa (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) sareng dialisis ngalawan 4 L panyangga dialisis (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0,1 mM) salila 10 jam.Kolom bursa kation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) disaruakeun sareng panyangga kasatimbangan (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Tau lysate disaring ngaliwatan filter PVDF 0,22 μm sarta nyuntik kana kolom dina laju aliran 1 ml / mnt.Élusi dilaksanakeun sacara bertahap, tau diélusi ku panyangga élusi 15–30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Fraksi dianalisis ku SDS-PAGE, sareng fraksi naon waé anu ngandung hiji pita kalayan beurat molekul anu diperkirakeun tina tau dikonsentrasi nganggo saringan centrifuge 10 kDa sareng diganti ku panyangga anu ngandung 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM sareng DTT 2 mM pikeun konsentrasi protéin ahirna nyaéta 100 μM.Leyuran protéin ieu lajeng ngaliwatan filter PVDF 0,22 μm, gancang beku sarta disimpen dina -80 ° C.Protéin K18 disayogikeun ku Prof Alberto Boffi.The purity persiapan éta> 95% sakumaha dikonfirmasi ku SDS-PAGE na MALDI-TOF / TOF.Rupa-rupa sistein sacara kimia dilabélan ku AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, AS) atanapi TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).dikonfirmasi ku absorbance na MALDI-TOF / TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau sareng K18 dilabélan ku sésa sistein asli dina posisi 191 sareng 322 nganggo Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Jérman) nuturkeun prosedur anu sami.Muatan bersih per peta résidu pikeun αS sareng Tau441 dihasilkeun nganggo CIDER66.
Padet poli-L-lisin (pLK DP 90-110 nurutkeun NMR ti supplier, Alamanda Polimér Inc, Huntsville, Alabama, AS) ieu leyur dina 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 nepi ka 10 konsentrasi mM, prosés sonicated pikeun 5 menit dina mandi cai ultrasonik jeung nyimpen dina -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, AS) jeung FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, AS) téh leyur dina cai sarta disebarkeun lega di LLPS panyangga.Dialisis ngaleungitkeun uyah anu ngotorkeun.Aranjeunna teras disaring ngaliwatan saringan jarum suntik kalayan ukuran pori 0,22 μm, sareng konsentrasina diitung nganggo refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, AS).Sampel LLPS disiapkeun dina suhu kamar dina urutan ieu: panyangga sareng ékstrusi dicampur sareng 1 mM tris (2-carboxythyl) fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2- (Étana- 1, 2-diyldinitrile) asam tetraacetic (EDTA, carboxynth) jeung campuran 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Saterusna αS jeung polikasi lebur (pilihan pLK atawa Tau) ditambahkeun.Pikeun ékspérimén séri waktos thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), nganggo total konsentrasi ThT janten satengah konsentrasi αS.Gently tapi tuntas campur sampel pikeun mastikeun aranjeunna homogen.Konsentrasi unggal komponén béda-béda ti ékspérimén ka ékspérimén, sakumaha anu dijelaskeun dina bagian Hasil.Azide dipaké dina konsentrasi 0,02% (w/v) iraha lilana percobaan ngaleuwihan 4 jam.Pikeun sakabéh analisa ngagunakeun sampel LLPS, ngidinan campuran pikeun equilibrate pikeun 5 menit saméméh analisis.Pikeun analisis hamburan cahaya, 150 µl sampel dimuat kana mikroplates 96-sumur non-beungkeut (µClear®, hideung, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-hiji, Kremsmünster, Austria) jeung ditutupan ku film napel.LLPs diawaskeun ku cara ngukur absorbance dina 350 nm di puseur solusi dina maca plat CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Jérman).Percobaan dilumangsungkeun dina rangkep tilu dina 25 ° C, sarta kasalahan diitung salaku simpangan baku tina mean.Fase éncér diukur ku sentrifugasi sampel sareng analisis gél SDS-PAGE, sareng fraksi αS dina fase éncér sareng konsentrasi diukur dina sababaraha solusi LLPS.Sampel 100 μl LLPS anu ngandung 1 μM AF488-dilabélan αS disiapkeun ku campuran lengkep diteruskeun ku sentrifugasi dina 9600 × g salami 30 menit, saatos éta endapanana biasana katingali.50 μl luhur supernatant dipaké pikeun kuantifikasi protéin maké gél SDS-PAGE.Gels diseken sareng saringan AF488 nganggo sistem pencitraan gél ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, AS) atanapi diwarnaan ku noda Coomassie sareng ditingali ku saringan anu pas.Pita anu dihasilkeun dianalisis nganggo ImageJ versi 1.53i (National Institutes of Health, USA).Percobaan dilumangsungkeun dina duplikat dina dua percobaan béda jeung hasil nu sarupa.
Ilaharna, 150 μl sampel diterapkeun kana mikroplates 96-sumur anu henteu ngariung sareng ditingali dina suhu kamar dina mikroskop inverted Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Jérman).Pikeun percobaan titik, pelat µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jérman) atanapi 96-sumur polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ogé dipaké.EL6000 halogén atawa lampu halida logam merkuri dipaké salaku sumber iluminasi (pikeun BF / DIC na WF Imaging, mungguh).Pikeun mikroskop WF, tujuan hawa pembesaran 40x (Leica Microsystems, Jérman) digunakeun pikeun museurkeun cahaya dina sampel sareng ngumpulkeunana.Pikeun sampel anu dilabélan AF488 sareng ThT, saringan éksitasi sareng émisi kalayan set saringan standar GFP, saringan bandpass éksitasi sareng émisi masing-masing, saringan bandpass 460-500 nm sareng 512-542 nm, sareng eunteung dichroic 495 nm.Pikeun conto anu dilabélan ku Atto647N, sét standar saringan Cy5 kalayan saringan bandpass éksitasi sareng émisi masing-masing 628-40 nm sareng 692-40 nm, sareng eunteung dichroic 660 nm dianggo.Pikeun mikroskop BF sareng DIC, paké tujuan kempelan cahaya anu dipantulkeun sami.Cahaya anu dikumpulkeun dirékam dina kaméra Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Jérman).Waktu paparan éta 50 mdet pikeun BF jeung DIC mikroskop imaging jeung 20-100 mdet pikeun WF mikroskop imaging.Pikeun babandingan, waktos paparan pikeun sadaya ékspérimén sareng ThT nyaéta 100 mdet.Percobaan time-lapse dilakukeun pikeun ngabayangkeun coalescence droplet, kalayan gambar dikumpulkeun unggal 100 mdet sababaraha menit.ImageJ (NIH, USA) dipaké pikeun analisis gambar.Ékspérimén dilaksanakeun dina rangkep tilu kalayan hasil anu sami.
Pikeun percobaan kolokalisasi, FRAP sareng rekonstruksi 3D, gambar dicandak dina mikroskop confocal Zeiss LSM 880 inverted nganggo édisi biru ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jérman).Sampel 50 µl diterapkeun kana piring µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Jérman), dirawat ku polimér hidrofilik (ibiTreat) sareng dipasang dina tujuan immersion minyak 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) dina DIC).Gambar dicandak nganggo garis laser argon 458 nm, 488 nm, sareng 633 nm kalayan resolusi 0.26 µm / piksel sareng waktos paparan 8 µs / piksel pikeun éksitasi sareng deteksi émisi windows 470-600 nm, 493-628 nm, sareng 638-755 nm dianggo pikeun ngabayangkeun ThT, AF488 sareng Atto647N masing-masing.Pikeun percobaan FRAP, fotografi time-lapse unggal sampel kacatet dina 1 pigura per detik.Percobaan dilaksanakeun dina rangkep tilu dina suhu kamar kalayan hasil anu sami.Sadaya gambar dianalisis nganggo parangkat lunak édisi biru Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jérman).Kurva FRAP dinormalisasi, diplot sareng dipasang kana data inténsitas / waktos anu diekstrak tina gambar nganggo Zen 2 nganggo OriginPro 9.1.Kurva pamulihan dipasang kana modél mono-eksponénsial pikeun ngitung difusi molekular kalayan istilah éksponénsial tambahan pikeun ngitung éfék pemutihan akuisisi.Urang lajeng diitung D ngagunakeun radius pemutihan nominal jeung recovery satengah hirup saméméhna ditangtukeun saperti dina persamaan Kang et al.5 35 ditémbongkeun.
Varian sistein tunggal αS disintésis sareng 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) dina posisi 24 (TEMPOL-24-αS) sareng 122 (TEMPOL-122-αS), masing-masing.Spin Labeling Pikeun percobaan EPR, konsentrasi αS diatur dina 100 μM sareng konsentrasi PEG nyaéta 15% (w / v).Pikeun rupa-rupa kaayaan agrégasi, rasio αS:pLK nyaéta 1:10, sedengkeun rasio αS:ΔNt-Tau jeung αS:Tau441 dipertahankeun dina 1:1.Pikeun percobaan titrasi ngariung dina henteuna crowding, TEMPOL-122-αS dijaga dina 50 μM jeung polycations anu titrated dina ngaronjatkeun konsentrasi, Nyiapkeun unggal kaayaan misah.Pangukuran CW-EPR dilaksanakeun nganggo spéktrométer Bruker ELEXSYS E580 X-band anu dilengkepan résonator Bruker ER4118 SPT-N1 anu beroperasi dina frékuénsi gelombang mikro (SHF) ~ 9,7 GHz.Suhu disetel dina 25 ° C sareng dikawasa ku cryostat nitrogén cair.Spéktra dicandak dina kaayaan teu jenuh dina kakuatan MW 4 mW, amplitudo modulasi 0,1 mT, sareng frékuénsi modulasi 100 kHz.Inténsitas spéktral dinormalisasi pikeun ngahindarkeun bédana konsentrasi spin antara sampel sareng kamungkinan réduksi spin kusabab konsentrasi sésa agén pangréduksi dina conto anu ngandung Tau441 atanapi ΔNt-Tau (aya dina solusi protéin asli).Nilai anu dipasihkeun tina g dicandak salaku hasil tina modeling spéktral EPR anu dilakukeun nganggo parangkat lunak Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) anu dilaksanakeun dina Matlab®67.Hiji/dua komponén modél isotropik dipaké pikeun model data.Saatos normalisasi sadaya sinyal, sésa-sésa diitung ku cara ngirangan unggal simulasi tina spéktrum ékspérimén anu saluyu.Pikeun analisis titrasi mengikat, inténsitas relatif pita katilu ka pita kadua spéktrum EPR dinormalisasi (IIII/III) dipaké pikeun ngawas beungkeutan polycations ka αS.Pikeun ngira-ngira konstanta disosiasi (Kd), kurva anu dihasilkeun dipasangan kana model perkiraan anu nganggap n situs beungkeutan anu idéntik sareng mandiri.
Percobaan spéktroskopi NMR dilaksanakeun maké Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spéktrométer dilengkepan cryoprobe jeung Z-gradién.Sadaya percobaan dilaksanakeun nganggo 130-207 µM αS sareng αS / ΔNt-Tau sareng pLK sarimbag dina 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 sareng dilaksanakeun dina 15 ° C.Pikeun ngawas LPS ku NMR, 10% PEG ditambahkeun kana sampel anu tos dicampur.The kimiawi shift perturbation plot (Gbr. 1b) nembongkeun rata 1H jeung 15N shifts kimiawi.Spéktra αS 2D1H-15N HSQC ditugaskeun dumasar kana tugas saméméhna (Éntri BMRB #25227) sareng dikonfirmasi ku ngarékam sareng nganalisa spéktra 3D HNCA, HNCO sareng CBCAcoNH.Pergeseran kimiawi 13Cα sareng 13Cβ diitung ku ayana ΔNt-Tau atanapi pLK pikeun ngukur kamungkinan parobihan dina tren struktur sekundér dibandingkeun sareng pergeseran kimiawi αS dina konformasi coil acak murni 68 (Gambar Tambahan 5c).Laju R1ρ diukur ku ngarékam ékspérimén hsqctretf3gpsi (dipidangkeun tina perpustakaan Bruker) kalayan telat 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, sareng 800 mdet, sareng fungsi eksponensial disaluyukeun kana telat inténsitas puncak anu béda. kali pikeun nangtukeun R1ρ jeung kateupastian eksperimen na.
Percobaan mikroskopi fluoresensi dua warna anu direngsekeun waktos dilaksanakeun dina mikroskop confocal fluoresensi MT200 anu direngsekeun waktos komersil (PicoQuant, Berlin, Jérman) sareng alat cacah foton tunggal (TCSPC) anu aya hubunganana waktos.Sirah dioda laser digunakeun pikeun éksitasi interleaved pulsed (PIE), sinarna ngaliwatan pandu gelombang mode tunggal sareng disetel ka kakuatan laser 10 ka 100 nW pikeun garis laser 481 nm sareng 637 nm diukur saatos eunteung dichroic.Ieu ensures laju cacah foton optimal, Ngahindarkeun efek tina foton aliasing, photobleaching jeung jenuh.μ-Slide angiogenesis coverslips atawa piring (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jérman) disimpen langsung dina cai immersion leuwih lénsa Super Apochromat 60x NA 1.2 kalawan kerah corrective (Olympus Life Sciences, Waltham, AS).Eunteung dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) dipaké salaku splitter beam utama.Radiasi anu henteu fokus diblokir ku liang anu diaméterna 50 mikron, teras radiasi anu fokus dibagi jadi 2 jalur deteksi ku 50/50 beam splitter.saringan émisi Bandpass (Semrock, Lake Forest, Il, AS) 520/35 pikeun ngalelep héjo (AF488) jeung 690/70 pikeun ngalelep beureum (Atto647N) dipaké di hareup detektor.Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy) dipaké salaku detéktor.Duanana ngumpulkeun data sareng analisa dilakukeun nganggo parangkat lunak SymphoTime64 anu sayogi komersil (PicoQuant GmbH, Berlin, Jerman).
Lima puluh mikroliter sampel LLPS diterapkeun kana sumur μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jérman).Gambar anu dihasilkeun dipuseurkeun ka 20 µm di luhur dasar sumur pikeun jarak kerja anu optimal pikeun titik-titik anu digantungkeun sareng ka ~1 µm pikeun rakit sareng titik-titik kalayan resolusi aksial sahenteuna 0,25 µm/piksel sareng waktos reureuh 400 µs/piksel.Pilih data ku cara nerapkeun ambang inténsitas dumasar kana rata-rata inténsitas sinyal latar (PBG, mean + 2σ) pikeun unggal saluran supados ngan ukur titik-titik protéin cair, rakit, atanapi bintik-bintik anu dipilih, nyaring asal-usul anu mungkin tina fase sumebar.Pikeun nganalisis umur hirup unggal spésiés (τ) unggal saluran (héjo, "g" kanggo AF488 sareng beureum, "r" kanggo Atto647N), kami milih daérah anu dipikaresep (ROI) anu ngandung titik-titik, rakit, atanapi bintik-bintik (Suplemén Gambar 1). ).8b) jeung diturunkeun ku cara nyocogkeun buruk hirupna (τD, τR jeung τP pikeun titisan, rakit atawa bintik, masing-masing, tingali Suplemén Gbr. 8c) dina unggal saluran ngagunakeun analisis buntut-fit jeung modél buruk dua-komponén.Rata-rata τ ti τ .ROI anu ngahasilkeun sakedik teuing foton pikeun pas multi-eksponénsial dikaluarkeun tina analisa.Potongan anu digunakeun nyaéta <104 foton pikeun rakit sareng titik sareng 103 kanggo tetes.Titisan ngagaduhan ambang anu langkung handap sabab hese kéngingkeun kurva buruk kalayan nilai inténsitas anu langkung luhur, sabab titik-titik dina médan gambar biasana langkung alit sareng kirang seueur.ROI kalayan jumlah foton di luhur wates akumulasi foton (disetél ka> 500 cacah / piksel) ogé dipiceun pikeun analisa.Cocogkeun kurva inténsitas buruk anu dicandak ti daérah anu dipikaresep kalayan inténsitas maksimal 90% (rada saatos inténsitas maksimal buruk) ti mimiti umur jasa pikeun mastikeun gangguan IRF minimal bari ngajaga anu sami pikeun sadaya inténsitas buruk. setélan Relatif jandela waktos Anu dianalisis 25 ka 50 ROI pikeun rakit jeung bintik na 15-25 ROI pikeun tetes, Gambar dipilih ti leuwih ti 4 ulangan dirékam tina sahanteuna 3 percobaan bebas.Tés-t dua buntut geus dipaké pikeun evaluate béda statistik antara spésiés atawa antara sistem coacervate.Pikeun analisis piksel-demi-piksel hirupna (τ), total atenuasi umur hirup dina sawah pikeun tiap saluran diitung sareng perkiraan model atenuasi eksponensial 2/3-komponén dilaksanakeun.Atenuasi hirupna pikeun tiap piksel lajeng dipasangan ngagunakeun nilai τ nu diitung saméméhna, hasilna gambar FLIM fit pseudocolor.Rentang hirupna buntut-pas éta sarua dina sakabéh gambar tina saluran nu sarua, sarta unggal buruk ngahasilkeun cukup foton pikeun nyadiakeun fit dipercaya.Pikeun analisa FRET, piksel dipilih ku cara nerapkeun ambang inténsitas handap 100 foton, anu rata-rata sinyal latar (FBG) tina 11 foton.Inténsitas fluoresensi unggal saluran dilereskeun ku faktor koreksi anu ditangtukeun sacara ékspériméntal: 69 spéktral crosstalk α nyaéta 0,004, éksitasi langsung β nyaéta 0,0305, efisiensi deteksi γ nyaéta 0,517.Efisiensi FRET dina tingkat piksel diitung ngagunakeun persamaan ieu:
dimana FDD nyaéta inténsitas fluoresensi anu dititénan dina saluran donor (héjo), FDA nyaéta inténsitas fluoresensi anu dititénan dina saluran akséptor (beureum) dina kaayaan éksitasi teu langsung, sarta FAA nyaéta inténsitas fluoresensi anu dititénan dina saluran akséptor (beureum) dina éksitasi langsung ( PIE).Pulsa inténsitas fluoresensi dititénan dina saluran).
Teundeun 100 µl larutan réaksi LLPS anu ngandung 25 µM monomérik Tau441 tanpa labél (sareng atanapi henteu nganggo 25 µM αS) dina panyangga LLPS (ditambahkeun sapertos di luhur) dina pelat mikro 96 sumur anu teu ngariung kalayan lapisan foil napel sareng formasi tetesan dipariksa saatos disalin ku mikro WF. kasatimbangan.dina 10 mnt.Saatos 48 jam inkubasi dina suhu kamar, ayana rakit protéin sareng bintik-bintik dikonfirmasi.Teras cabut cairan tina sumur sacara saksama, teras tambahkeun 50 L panyangga disosiasi (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) sareng inkubasi salami 10 mnt.Konsentrasi uyah anu luhur mastikeun yén LLPS moal ngulang kusabab sésa PEG, sareng kamungkinan rakitan protéin anu dibentuk ngan ku interaksi éléktrostatik bakal dibongkar.Handapeun sumur ieu lajeng taliti scraped kaluar kalawan micropipette tip sarta leyuran hasilna dipindahkeun ka hiji sumur observasi kosong.Saatos inkubasi sampel kalawan 50 μM ThT pikeun 1 h, ayana spot terasing dipariksa ku mikroskop WF.Nyiapkeun fibrils αS sonicated ku incubating 300 µl solusi 70-µM αS dina PBS kalawan pH 7.4, natrium azide 0.01% dina 37 °C jeung 200 rpm dina shaker orbital salila 7 poé.Leyuran ieu lajeng centrifuged di 9600 × g pikeun 30 mnt, pellet ieu resuspended dina PBS pH 7.4 sarta sonicated (1 mnt, 50% siklus, 80% amplitudo dina Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, AS) sampel fibril. kalawan distribusi ukuran rélatif seragam fibrils leutik.
Analisis FCS / FCCS sareng deteksi kabeneran dua warna (TCCD) dilakukeun dina mikroskop confocal fluoresensi MT200 anu sami (Pico-Quant, Berlin, Jérman) anu dianggo pikeun percobaan mikroskop FLIM-FRET nganggo mode PIE.Daya laser pikeun percobaan ieu ditambahkeun kana 6.0 µW (481 nm) jeung 6.2 µW (637 nm).Kombinasi kakuatan laser ieu dipilih pikeun ngahasilkeun kacaangan nu sarupa pikeun pasangan fluorophores dipaké bari achieving ongkos count optimal sarta Ngahindarkeun photobleaching na jenuh.Duanana ngumpulkeun data sareng analisa dilakukeun nganggo parangkat lunak SymphoTime64 versi 2.3 anu sayogi komersil (PicoQuant, Berlin, Jerman).
Sampel agrégat αS/Tau terisolasi diala maké LLPS éncér dina panyangga isolasi nepi ka konsentrasi monomolekul anu luyu (biasana éncér 1:500, sabab agrégat geus aya dina konséntrasi handap nalika diisolasi tina sampel coacervate).Sampel diterapkeun langsung kana panutup panutup (Corning, AS) anu dilapis ku larutan BSA dina konsentrasi 1 mg/mL.
Pikeun analisa PIE-smFRET dina saluran héjo sareng beureum, ambang inténsitas handap tina 25 foton diterapkeun pikeun nyaring sinyal inténsitas rendah anu disababkeun ku kajadian monomér (perhatikeun yén monomér langkung seueur conto agrégat dibandingkeun sareng agrégat terasing).Ambang ieu diitung salaku lima kali inténsitas rata-rata αS monomér anu dicandak tina analisis sampel monomér murni pikeun milih agrégat sacara khusus pikeun dianalisis.Sirkuit drive PIE, sareng akuisisi data TSCPC, parantos ngaktifkeun aplikasi saringan timbangan umur hirup anu ngabantosan ngaleungitkeun latar tukang sareng crosstalk spéktral.Inténsitas flare anu dipilih nganggo ambang di luhur dilereskeun nganggo sinyal latar tukang rata-rata anu ditangtukeun tina histogram kajadian versus inténsitas / bin tina conto panyangga wungkul.Bursts pakait sareng agrégat badag ilaharna nempatan sababaraha bin padeukeut dina waktu renik (set ka 1 ms).Dina kasus ieu, bin kakuatan maksimum dipilih.Pikeun analisa FRET sareng stoichiometric, faktor gamma γ (0.517) anu ditangtukeun sacara téoritis dianggo.crosstalk spéktral jeung kontribusi éksitasi langsung negligible (ditangtukeun ékspériméntal) dina kakuatan laser éksitasi dipaké.Efisiensi sareng stoikiometri FRET dina ledakan diitung sapertos kieu.