Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.

317 suppliers pipah coil stainless steel

Méja komposisi kimia tina bahan stainless steel

SPACA6 mangrupikeun protéin permukaan anu dikedalkeun spérma anu penting pikeun fusi gamét nalika réproduksi seksual mamalia.Sanajan peran fundamental ieu, fungsi husus tina SPACA6 kirang dipikaharti.Kami ngajelaskeun struktur kristal domain ekstrasélular SPACA6 dina résolusi 2.2 Å, ngungkabkeun protéin dua domain anu diwangun ku kebat opat-stranded sareng β-sandwich sapertos Ig dihijikeun ku panyambung kuasi-fléksibel.Struktur ieu nyarupaan IZUMO1, protéin séjén nu pakait fusi gamét, ngajadikeun SPACA6 na IZUMO1 anggota pangadeg superfamili protéin nu patali fértilisasi disebut di dieu salaku superfamili IST.Superfamili IST sacara stuktur didefinisikeun ku iket opat-héliks anu bengkok sareng sapasang motif CXXC anu aya hubunganana disulfida.A pilarian AlphaFold basis struktur tina proteome manusa dicirikeun anggota protéin tambahan tina superfamily ieu;utamana, loba protéin ieu aub dina fusi gamét.Struktur SPACA6 sareng hubunganana sareng anggota superfamily IST anu sanés nyayogikeun tautan anu leungit dina pangaweruh urang ngeunaan fusi gamét mamalia.
Unggal kahirupan manusa dimimitian ku dua gamet haploid misah: spérma bapa jeung endog indungna.spérma ieu téh juara prosés seleksi sengit salila jutaan sél spérma ngaliwatan saluran séks bikang, nungkulan sagala rupa halangan1 sarta ngalaman kapasitas, nu ngaronjatkeun motilitas maranéhanana sarta prosés komponén permukaan2,3,4.Sanaos spérma sareng oosit silih mendakan, prosésna henteu acan réngsé.Oosit dikurilingan ku lapisan sél cumulus sarta panghalang glikoprotein nu disebut zona pellucida, nu ngaliwatan spérma kudu ngaliwatan asup ka oosit.Spermatozoa ngagunakeun kombinasi molekul adhesion permukaan jeung énzim nu patali jeung mémbran jeung disékrésikeun pikeun nungkulan halangan ahir ieu5.Molekul jeung énzim ieu utamana disimpen dina mémbran jero jeung matriks akrosomal sarta dideteksi nalika mémbran luar spérma dilisiskeun salila réaksi akrosomal6.Léngkah ahir dina lalampahan sengit ieu nyaéta acara fusi spérma-endog, dimana dua sél ngahiji mémbran maranéhna pikeun jadi hiji organisme diploid tunggal7.Sanajan prosés ieu téh groundbreaking dina réproduksi manusa, interaksi molekular diperlukeun téh kirang dipikaharti.
Salian fértilisasi gamet, kimia fusi dua lapisan ganda lipid geus ditalungtik sacara éksténsif.Sacara umum, fusi mémbran nyaéta prosés anu teu nguntungkeun sacara énergetik anu merlukeun katalis protéin pikeun ngalaman parobahan konformasi struktur anu ngadeukeutkeun dua mémbran, megatkeun kontinuitasna sarta ngabalukarkeun fusi8,9.Katalis protéin ieu katelah fusogens sarta geus kapanggih dina sistem fusi countless.Éta dipikabutuh pikeun asupna virus kana sél inang (misalna, gp160 dina HIV-1, spike dina coronaviruses, hemagglutinin dina virus influenza) 10,11,12 plaséntal (syncytin)13,14,15 jeung fusi-ngabentuk gamét dina eukariota handap ( HAP2/GCS1 dina tutuwuhan, protista jeung artropoda) 16,17,18,19.Fusogens pikeun gamét manusa can kapanggih, sanajan sababaraha protéin geus kabuktian kritis pikeun kantétan gamét jeung fusi.CD9 anu diekspresikeun oosit, protéin transmembran anu dipikabutuh pikeun ngahijikeun gamet beurit sareng manusa, mangrupikeun anu munggaran kapanggih 21,22,23.Sanajan fungsi tepat na tetep can écés, peran dina adhesion, struktur adhesion foci on microvilli endog, jeung / atawa lokalisasi bener protéin permukaan oocyte sigana kamungkinan 24,25,26.Dua protéin anu paling khas anu penting pikeun fusi gamét nyaéta protéin spérma IZUMO127 sareng protéin oosit JUNO28, sareng asosiasi silih mangrupikeun léngkah anu penting dina pangakuan sareng adhesi gamét sateuacan fusi.Mencit knockout Izumo1 jalu jeung beurit Juno knockout bikang sagemblengna steril, dina model ieu spérma asup kana rohangan perivitelline tapi gamet teu ngahiji.Nya kitu, confluence ieu ngurangan nalika gametes dirawat kalayan anti IZUMO1 atanapi JUNO27,29 antibodi dina percobaan fértilisasi in vitro manusa.
Anyar-anyar ieu, grup protéin anu diekspresikeun spérma anu énggal-énggal sami sareng IZUMO1 sareng JUNO20,30,31,32,33,34,35 parantos kapanggih.Spérma acrosomal mémbran-pakait protéin 6 (SPACA6) geus diidentifikasi minangka penting pisan pikeun fértilisasi dina studi mutagenesis murine skala badag.Nyelapkeun transgén kana gén Spaca6 ngahasilkeun spérmatozoa nonfusible, sanajan spérmatozoa ieu infiltrate rohangan perivitelline 36 .Studi knockout saterusna dina mencit dikonfirmasi yén Spaca6 diperlukeun pikeun fusi gamét 30,32.SPACA6 diekspresikeun ampir sacara éksklusif dina téstés sarta mibanda pola lokalisasi nu sarupa jeung IZUMO1, nyaéta dina jero intima spérmatozoa saméméh réaksi akrosomal, terus pindah ka wewengkon katulistiwa sanggeus réaksi akrosomal 30,32.Homolog Spaca6 aya dina rupa-rupa mamalia jeung eukariota séjén 30 sarta pentingna pikeun fusi gamét manusa geus ditémbongkeun ku inhibisi fértilisasi manusa in vitro ku lalawanan ka SPACA6 30 .Beda sareng IZUMO1 sareng JUNO, detil struktur, interaksi, sareng fungsi SPACA6 tetep teu jelas.
Pikeun langkung ngartos prosés dasar anu ngahijikeun spérma sareng endog manusa, anu bakal ngamungkinkeun urang pikeun nginpokeun kamajuan kahareup dina KB sareng perawatan kasuburan, kami ngalaksanakeun studi struktural sareng biokimia SPACA6.Struktur kristal domain ekstrasélular tina SPACA6 nembongkeun kebat opat-héliks (4HB) jeung hiji domain immunoglobulin-kawas (Ig-kawas) disambungkeun ku wewengkon quasi-fléksibel.Salaku diprediksi dina studi saméméhna, 7,32,37 struktur domain of SPACA6 téh sarupa jeung nu IZUMO1 manusa, sarta dua protéin babagi hiji motif mahiwal: 4HB kalawan beungeut hélik triangular sarta sapasang motif CXXC disulfida-numbu.Kami ngajukeun yén IZUMO1 sareng SPACA6 ayeuna netepkeun superfamili protéin anu langkung ageung sareng struktural anu aya hubunganana sareng fusi gamét.Ngagunakeun fitur unik keur superfamily, urang ngalaksanakeun hiji pilarian tuntas pikeun proteome struktural manusa AlphaFold, identifying anggota tambahan tina superfamily ieu, kaasup sababaraha anggota aub dina fusi gamét jeung / atawa fértilisasi.Ayeuna katingali aya lipatan struktural umum sareng superfamili protéin anu aya hubunganana sareng fusi gamét, sareng struktur kami nyayogikeun peta molekular aspék penting ieu mékanisme fusi gamét manusa.
SPACA6 nyaéta protéin transmembrane pass tunggal sareng hiji glycan numbu N sareng genep beungkeut disulfida putative (Gambar S1a sareng S2).Urang dikedalkeun domain extracellular of SPACA6 manusa (résidu 27-246) dina sél Drosophila S2 sarta dimurnikeun protéin maké pangirut nikel, bursa kation, sarta kromatografi pangaluaran ukuranana (Gbr. S1b).Ectodomain SPACA6 anu dimurnikeun stabil pisan sareng homogen.Analisis ngagunakeun kromatografi pangaluaran ukuran digabungkeun jeung paburencay cahaya polygonal (SEC-MALS) ngungkabkeun hiji puncak kalayan beurat molekul diitung 26,2 ± 0,5 kDa (Gbr. S1c).Ieu konsisten jeung ukuran ectodomain monomeric SPACA6, nunjukkeun yén oligomerization teu lumangsung salila purifikasi.Sajaba ti éta, spéktroskopi sirkular dichroism (CD) ngungkabkeun struktur α/β campuran kalayan titik lebur 51,3 °C (Gbr. S1d,e).Dekonvolusi spéktra CD ngungkabkeun 38,6% α-héliks sareng 15,8% unsur β-stranded (Gambar S1d).
The SPACA6 ectodomain ieu crystallized maké matrix seeding38 acak hasilna set data kalawan resolusi 2.2 Å (Table 1 jeung Gambar S3).Ngagunakeun kombinasi substitusi molekular dumasar-fragmén jeung data phasing SAD kalawan paparan bromide pikeun tekad struktur (Tabel 1 jeung Gambar S4), model refined final diwangun ku résidu 27-246.Nalika strukturna ditangtukeun, teu aya struktur ékspérimén atanapi AlphaFold anu sayogi.Ectodomain SPACA6 ukuran 20 Å × 20 Å × 85 Å, diwangun ku tujuh hélik jeung salapan β-untaian, sarta ngabogaan lipatan térsiér manjang distabilkeun ku genep beungkeut disulfida (Gbr. 1a, b).Dénsitas éléktron lemah dina tungtung ranté samping Asn243 nunjukkeun yén résidu ieu mangrupa glikosilasi N-numbu.Strukturna diwangun ku dua domain: hiji N-terminal opat-héliks kebat (4HB) jeung C-terminal Ig-kawas domain kalawan wewengkon hinge panengah antara aranjeunna (Gbr. 1c).
a Struktur domain extracellular of SPACA6.Diagram strip domain ekstrasélular SPACA6, warna ranté tina N ka C-terminus ti biru poék nepi ka beureum poék.Sistein aub dina beungkeut disulfida disorot dina magénta.b Topologi domain ekstrasélular SPACA6.Paké skéma warna sarua sakumaha dina Gambar 1a.c SPACA6 domain ekstrasélular.Bagan jalur domain 4HB, hinge, sareng Ig diwarnaan oranyeu, héjo, sareng biru, masing-masing.Lapisan henteu digambar kana skala.
4HB domain of SPACA6 ngawengku opat héliks utama (héliks 1-4), nu disusun dina wangun héliks hélik (Gbr. 2a), silih ganti antara interaksi antiparalel jeung paralel (Gbr. 2b).Hiji tambahan leutik héliks single-turn (héliks 1′) diteundeun jejeg bundle, ngabentuk segitiga kalayan héliks 1 jeung 2. Segitiga ieu rada cacad dina bungkusan hélik-twisted tina packing rélatif padet héliks 3 jeung 4 ( Gbr. 2a).
4HB N-terminal strip bagan.b Témbongkeun luhureun hiji kebat opat héliks, unggal héliks disorot ku biru poék dina N-terminus jeung beureum poék dina C-terminus.c diagram kabayang spiral luhur-handap pikeun 4HB, kalawan unggal résidu ditémbongkeun salaku bunderan dilabélan ku hiji-hurup kode asam amino;ngan opat asam amino dina luhureun kabayang nu wilanganana.Résidu non-polar diwarnaan koneng, résidu anu teu boga muatan polar diwarnaan héjo, résidu anu muatanana positip diwarnaan bulao, sarta résidu anu boga muatan négatif diwarnaan beureum.d Raray segitiga tina domain 4HB, kalawan 4HBs dina jeruk jeung hinges dina héjo.Duanana insets nembongkeun beungkeut disulfida ngawangun rod.
4HB konséntrasi dina inti hidrofobik jero diwangun utamana ku résidu alifatik jeung aromatik (Gbr. 2c).Inti ngandung beungkeut disulfida antara Cys41 na Cys55 nu numbu héliks 1 jeung 2 babarengan dina segitiga diangkat luhur (Gbr. 2d).Dua beungkeut disulfida tambahan kabentuk antara motif CXXC dina Helix 1 'sarta motif CXXC sejen kapanggih dina ujung β-hairpin di wewengkon hinge (Gbr. 2d).Résidu arginin konservatif kalayan fungsi anu teu dipikanyaho (Arg37) aya di jero segitiga kerung anu dibentuk ku hélik 1′, 1, sareng 2. Atom karbon alifatik Cβ, Cγ, sareng Cδ Arg37 berinteraksi sareng inti hidrofobik, sareng gugus guanidinna sacara siklus gerak. antara hélik 1 'jeung 1 via interaksi antara tulang tonggong Thr32 jeung ranté samping (Gbr. S5a, b).Tyr34 ngalegaan kana rongga ninggalkeun dua rongga leutik dimana Arg37 tiasa berinteraksi sareng pangleyur.
Domain β-sandwich Ig-kawas mangrupakeun superfamili badag protéin nu babagi fitur umum dua atawa leuwih multi-stranded amphipathic β-lambar interacting via inti hidrofobik 39. C-terminal Ig-kawas domain tina SPACA6 boga pola nu sarua. sarta diwangun ku dua lapisan (Gbr. S6a).Lembar 1 mangrupa β-lambar tina opat untaian (unai D, F, H, jeung I) dimana untaian F, H, jeung I ngabentuk susunan anti paralel, sarta untaian I jeung D nyandak hiji interaksi paralel.Méja 2 nyaéta lambaran béta untaian ganda anti paralel leutik (tali E jeung G).Beungkeut disulfida internal dititénan antara C-terminus ranté E jeung puseur ranté H (Cys170-Cys226) (Gbr. S6b).Beungkeut disulfida ieu analog jeung beungkeut disulfida dina domain β-sandwich immunoglobulin40,41.
Opat-strand β-lambar pulas sapanjang sakabéh panjangna, ngabentuk ujung asimétri nu béda dina wangun jeung éléktrostatik.Ujung thinner mangrupakeun permukaan lingkungan hidrofobik datar nu nangtung kaluar dibandingkeun jeung surfaces sésana henteu rata jeung electrostatically rupa-rupa di SPACA6 (Gbr. S6b, c).Hiji halo tina kakeunaan gugus karbonil / amino tulang tonggong jeung ranté samping polar ngurilingan beungeut hidrofobik (Gbr. S6c).Margin nu leuwih lega katutupan ku ruas hélik katutupan nu ngahalangan bagian N-terminal inti hidrofobik sarta ngabentuk tilu beungkeut hidrogén jeung gugus polar kabuka tina tulang tonggong ranté F (Gbr. S6d).Bagian C-terminal ujung ieu ngabentuk saku badag kalayan inti hidrofobik sawaréh kakeunaan.Saku dikurilingan ku muatan positif alatan tilu sét résidu arginin ganda (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 jeung Arg212-Arg214) sarta histidine sentral (His220) (Gambar S6e).
Wewengkon engsel mangrupakeun bagéan pondok antara domain hélik jeung domain kawas Ig, diwangun ku hiji antiparalel tilu-stranded β-lapisan (untaian A, B jeung C), hiji 310 héliks leutik, sarta sababaraha bagéan hélik acak panjang.(Gbr. S7).Jaringan kontak kovalén sareng éléktrostatik di daérah engsel sigana nyaimbangkeun orientasi antara 4HB sareng domain sapertos Ig.Jaringan bisa dibagi jadi tilu bagian.Bagian kahiji ngawengku dua motif CXXC (27CXXC30 jeung 139CXXC142) nu ngawangun sapasang beungkeut disulfida antara β-hairpin dina hinge jeung 1′ héliks dina 4HB.Bagian kadua ngawengku interaksi éléktrostatik antara domain Ig-kawas jeung hinge nu.Glu132 dina hinge ngabentuk sasak uyah jeung Arg233 dina domain kawas Ig jeung Arg135 dina hinge nu.Bagian katilu ngawengku beungkeut kovalén antara domain kawas Ig jeung wewengkon hinge.Dua beungkeut disulfida (Cys124-Cys147 na Cys128-Cys153) nyambungkeun loop hinge ka linker nu stabilized ku interaksi éléktrostatik antara Gln131 jeung gugus fungsi tulang tonggong, sahingga aksés ka domain kawas Ig munggaran.ranté.
Struktur ectodomain SPACA6 jeung struktur individu 4HB na Ig-kawas domain anu dipaké pikeun milarian rékaman Sacara stuktur sarupa dina database protéin 42.Kami ngaidentipikasi patandingan sareng skor Dali Z anu luhur, simpangan standar anu alit, sareng skor LALI ageung (anu terakhir mangrupikeun jumlah résidu anu sarimbag sacara struktural).Sedengkeun 10 hits munggaran ti pilarian ectodomain pinuh (Table S1) miboga Z-skor ditarima tina> 842, pilarian pikeun 4HB atanapi Ig-kawas domain nyalira némbongkeun yén lolobana hits ieu pakait jeung β-sandwich wungkul.lipatan ubiquitous kapanggih dina loba protéin.Katiluna panéangan di Dali ngan ukur hiji hasil: IZUMO1.
Geus lila ngusulkeun yén SPACA6 na IZUMO1 babagi kamiripan struktural7,32,37.Sanajan ectodomains dua protéin nu pakait fusi gamét ieu babagi ngan 21% identitas runtuyan (Gambar S8a), bukti kompléks, kaasup pola beungkeut disulfida conserved sarta diprediksi C-terminal Ig-kawas domain di SPACA6, diwenangkeun usaha mimiti ngawangun a modél homologi A a SPACA6 mouse ngagunakeun IZUMO1 salaku template37.Struktur kami negeskeun prediksi ieu sareng nunjukkeun tingkat kamiripan anu leres.Kanyataanna, struktur SPACA6 na IZUMO137,43,44 sarua arsitéktur dua-domain (Gbr. S8b) kalawan 4HB na Ig-kawas β-sandwich domain sarupa disambungkeun ku wewengkon hinge (Gbr. S8c).
IZUMO1 na SPACA6 4HB gaduh béda umum ti bundles spiral konvensional.4HBs has, kawas nu kapanggih dina kompléx protéin SNARE aub dina fusi endosomal 45,46, geus merata spasi héliks ngajaga curvature konstan sabudeureun sumbu sentral 47. Kontras, domain hélik dina duanana IZUMO1 na SPACA6 anu menyimpang, kalawan curvature variabel sarta bungkusan henteu rata (Gambar S8d).The pulas, meureun disababkeun ku segitiga dibentuk ku héliks 1 ', 1 jeung 2, dipikagaduh di IZUMO1 na SPACA6 sarta stabilized ku motif CXXC sarua on helix 1'.Sanajan kitu, beungkeut disulfida tambahan kapanggih dina SPACA6 (Cys41 na Cys55 kovalén numbu hélik 1 jeung 2 di luhur) nyiptakeun pungkal seukeut dina pungkal segitiga, sahingga SPACA6 leuwih twisted ti IZUMO1, kalawan triangles rongga leuwih jelas.Sajaba ti éta, IZUMO1 lacks Arg37 observasi dina puseur rongga ieu SPACA6.Sabalikna, IZUMO1 gaduh inti hidrofobik anu langkung khas tina résidu alifatik sareng aromatik.
IZUMO1 boga domain kawas Ig nu diwangun ku β-sheet-stranded ganda jeung lima-stranded43.Strand tambahan dina IZUMO1 ngagantikeun coil di SPACA6, anu berinteraksi sareng untaian F pikeun ngawatesan beungkeut hidrogén tulang tonggong dina untaian.Hiji titik metot ngabandingkeun nyaéta muatan permukaan diprediksi tina domain Ig-kawas tina dua protéin.Beungeut IZUMO1 langkung muatanana négatif tibatan permukaan SPACA6.Muatan tambahan perenahna deukeut C-terminus nyanghareup mémbran spérma.Dina SPACA6, wewengkon anu sarua leuwih nétral atawa boga muatan positif (Gbr. S8e).Contona, permukaan hidrofobik (ujung thinner) jeung liang muatan positif (ujung lega) dina SPACA6 boga muatan négatip di IZUMO1.
Sanajan hubungan jeung elemen struktur sekundér antara IZUMO1 na SPACA6 ogé dilestarikan, alignment struktural tina domain Ig-kawas némbongkeun yén dua domain béda dina orientasi umum maranéhanana relatif ka silih (Gbr. S9).Bungkusan spiral IZUMO1 melengkung ngeunaan β-sandwich, nyiptakeun bentuk "boomerang" anu dijelaskeun sateuacana sakitar 50 ° ti sumbu tengah.Sabalikna, sinar hélik dina SPACA6 dimiringkeun sakitar 10 ° dina arah anu sabalikna.Bedana dina orientasi ieu kamungkinan alatan béda dina wewengkon hinge.Dina tingkat runtuyan primér, IZUMO1 na SPACA6 babagi saeutik kamiripan runtuyan dina hinge, iwal sistein, glisin, sarta résidu asam aspartat.Hasilna, beungkeut hidrogén jeung jaringan éléktrostatik sagemblengna béda.β-lembar elemen struktur sekundér dibagikeun ku IZUMO1 na SPACA6, sanajan ranté dina IZUMO1 leuwih panjang sarta 310 héliks (héliks 5) unik keur SPACA6.Bédana ieu nyababkeun orientasi domain anu béda pikeun dua protéin anu sanés sami.
Pilarian server Dali kami ngungkabkeun yén SPACA6 sareng IZUMO1 mangrupikeun hiji-hijina dua struktur anu ditangtukeun sacara ékspériméntal anu disimpen dina pangkalan data protéin anu ngagaduhan lipatan 4HB tinangtu ieu (Table S1).Nu leuwih anyar, DeepMind (Alfabét/Google) geus ngembangkeun AlphaFold, sistem jaringan neural dumasar nu akurat bisa ngaduga struktur 3D protéin tina sequences primér48.Teu lila sanggeus urang direngsekeun struktur SPACA6, database AlphaFold dileupaskeun, nyadiakeun model struktur prediksi ngawengku 98,5% sadaya protéin dina proteome48,49 manusa.Ngagunakeun struktur SPACA6 kami direngsekeun salaku modél pilarian, pilarian homologi struktural pikeun modél dina proteome manusa AlphaFold dicirikeun calon kalawan kamiripan struktural mungkin mun SPACA6 na IZUMO1.Dibikeun akurasi luar biasa tina AlphaFold dina ngaramal SPACA6 (Gbr. S10a) -utamana 1.1 Å rms ectodomain dibandingkeun struktur direngsekeun kami (Gbr. S10b) -urang tiasa yakin yén cocog SPACA6 dicirikeun kamungkinan akurat.
Saméméhna, PSI-BLAST milarian klaster IZUMO1 sareng tilu protéin anu aya hubunganana spérma: IZUMO2, IZUMO3, sareng IZUMO450.AlphaFold ngaramalkeun yén protéin kulawarga IZUMO ieu ngalipet kana domain 4HB kalayan pola beungkeut disulfida anu sami sareng IZUMO1 (Gambar 3a sareng S11), sanaos aranjeunna henteu gaduh domain sapertos Ig.Dihipotesiskeun yén IZUMO2 sareng IZUMO3 mangrupikeun protéin mémbran hiji sisi anu sami sareng IZUMO1, sedengkeun IZUMO4 sigana disékrésikeun.Fungsi protéin IZUMO 2, 3, jeung 4 dina fusi gamét teu acan ditangtukeun.IZUMO3 dipikanyaho maénkeun peran dina biogenesis akrosom salila ngembangkeun spérmatozoa51, sarta protéin IZUMO ngabentuk kompléks50.Konservasi protéin IZUMO dina mamalia, réptil, jeung amfibi nunjukkeun yén fungsi poténsi maranéhanana konsisten jeung protéin lianna dipikawanoh gamét-fusi-pakait, kayaning DCST1/2, SOF1, jeung FIMP.
Diagram arsitéktur domain IST superfamily, kalawan 4HB, hinge, jeung domain kawas Ig disorot dina oranyeu, héjo, jeung biru, masing-masing.IZUMO4 boga wewengkon C-terminal unik nu Sigana hideung.Beungkeut disulfida anu dikonfirmasi sareng putative ditingalikeun ku garis padet sareng titik-titik, masing-masing.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM95) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) dipintonkeun dina rentang warna anu sarua sakumaha panel A. Beungkeut disulfida ditémbongkeun dina magénta.TMEM95, IZUMO2 na IZUMO3 héliks transmembrane teu ditémbongkeun.
Teu kawas protéin IZUMO, protéin SPACA séjén (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, sarta SPACA9) dianggap struktural béda ti SPACA6 (Gbr. S12).Ngan SPACA9 boga 4HB, tapi teu diperkirakeun boga orientasi paralel-anti paralel sarua atawa beungkeut disulfida sarua SPACA6.Ngan SPACA1 boga domain kawas Ig sarupa.AlphaFold prédiksi yén SPACA3, SPACA4 na SPACA5 boga struktur lengkep beda ti SPACA6.Narikna, SPACA4 ogé dipikawanoh maénkeun peran dina fértilisasi, tapi ka extent gede ti SPACA6, tinimbang facilitating interaksi antara spérma jeung oocyte zona pellucida52.
Pilarian AlphaFold kami mendakan patandingan anu sanés pikeun IZUMO1 sareng SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, protéin transmembrane spérma-spésifik tunggal, ngajadikeun mencit jalu infertile nalika ablated 32,33.Spermatozoa kakurangan TMEM95 miboga morfologi normal, motilitas, jeung kamampuhan pikeun nembus zona pellucida sarta ngabeungkeut mémbran endog, tapi teu bisa ngahiji jeung mémbran oocyte.Panaliti saméméhna nunjukkeun yén TMEM95 ngabagi kamiripan struktural sareng IZUMO133.Mémang, modél AlphaFold dikonfirmasi yén TMEM95 nyaéta 4HB sareng pasangan motif CXXC anu sami sareng IZUMO1 sareng SPACA6 sareng beungkeut disulfida tambahan anu sami antara hélik 1 sareng 2 kapanggih dina SPACA6 (Gbr. 3a sareng S11).Sanajan TMEM95 lacks hiji domain Ig-kawas, mibanda wewengkon kalawan pola beungkeut disulfida sarupa jeung SPACA6 na IZUMO1 wewengkon hinge (Gbr. 3b).Dina waktu publikasi naskah ieu, server preprint ngalaporkeun struktur TMEM95, confirming hasil AlphaFold53.TMEM95 pisan sarupa SPACA6 na IZUMO1 sarta évolusionér conserved geus di amfibi (Gbr. 4 jeung S13).
Pilarian PSI-BLAST ngagunakeun NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, sareng basis data SOF1 pikeun nangtukeun posisi sekuen ieu dina tangkal kahirupan.Jarak antara titik cabang teu ditémbongkeun skala.
Kasaruaan struktural umumna antara SPACA6 sareng IZUMO1 nunjukkeun yén aranjeunna mangrupikeun anggota pangadeg superfamili struktural anu dilestarikan anu kalebet protéin TMEM95 sareng IZUMO 2, 3, sareng 4.anggota dipikawanoh: IZUMO1, SPACA6 na TMEM95.Kusabab ngan ukur sababaraha anggota anu gaduh domain sapertos Ig, ciri khas superfamili IST nyaéta domain 4HB, anu ngagaduhan fitur unik anu umum pikeun sadaya protéin ieu: 1) Coiled 4HB kalayan hélik anu disusun dina alternation anti paralel / paralel (Gbr. . 5a), 2) kebat ngabogaan raray triangular diwangun ku dua helices dina kebat jeung helix nangtung katilu (Gbr. aréa konci (Gbr. 5c). Motif CXXC, kapanggih dina protéin thioredoxin-kawas, dipikawanoh pikeun fungsi. salaku sénsor rédoks 54,55,56, sedengkeun motif dina anggota kulawarga IST tiasa dipatalikeun sareng isomerase disulfida protéin sapertos ERp57 dina fusi gamét. Peran pakait 57,58.
Anggota superfamili IST didefinisikeun ku tilu fitur karakteristik domain 4HB: opat hélik silih ganti antara orientasi paralel jeung antiparalel, beungeut bundel hélik ba-triangular, sarta motif ganda ca CXXC kabentuk antara molekul leutik.) Héliks terminal-N (oranyeu) jeung wewengkon hinge β-jepit rambut (héjo).
Dibikeun kasaruaan antara SPACA6 sareng IZUMO1, kamampuan tilas ngabeungkeut IZUMO1 atanapi JUNO diuji.Biolayer interferometry (BLI) mangrupikeun metode beungkeutan dumasar kinétik anu saacanna dianggo pikeun ngitung interaksi antara IZUMO1 sareng JUNO.Saatos inkubasi tina sensor biotin-dilabélan kalawan IZUMO1 salaku bait kalawan konsentrasi luhur analyte JUNO, sinyal kuat ieu kauninga (Gbr. S14a), nunjukkeun parobahan mengikat-ngainduksi dina ketebalan tina biomaterial napel ujung sensor.Sinyal sarupa (ie, JUNO gandeng kana sensor salaku bait ngalawan IZUMO1 analyte) (Gbr. S14b).Henteu aya sinyal anu dideteksi nalika SPACA6 dianggo salaku analit ngalawan IZUMO1 kabeungkeut sensor atanapi JUNO kabeungkeut sensor (Gambar S14a,b).Henteuna sinyal ieu nunjukkeun yén domain ekstrasélular SPACA6 henteu berinteraksi sareng domain ekstrasélular IZUMO1 atanapi JUNO.
Kusabab assay BLI dumasar kana biotinilasi résidu lisin bébas dina protéin bait, modifikasi ieu bisa nyegah ngariung lamun résidu lisin aub dina interaksi.Sajaba ti éta, orientasi tina beungkeutan relatif ka sensor bisa nyieun hindrances steric, jadi assays pull-handap konvensional ogé dipigawé dina rekombinan SPACA6, IZUMO1 na JUNO ectodomains.Sanajan kitu, SPACA6 henteu endapanana kalawan IZUMO1-Na-tagged atawa JUNO-Na-tagged (Gbr. S14c, d), nunjukkeun euweuh interaksi konsisten jeung nu observasi dina percobaan BLI.Salaku kontrol positif, urang dikonfirmasi interaksi JUNO kalawan dilabélan Na IZUMO1 (Angka S14e na S15).
Sanajan kasaruaan struktural antara SPACA6 na IZUMO1, henteu mampuh SPACA6 ngabeungkeut JUNO teu heran.Beungeut IZUMO1 manusa boga leuwih ti 20 résidu nu berinteraksi sareng JUNO, kaasup résidu ti unggal tilu wewengkon (sanajan lolobana aya di wewengkon hinge) (Gbr. S14f).Tina résidu ieu, ngan hiji anu dilestarikan di SPACA6 (Glu70).Bari loba substitusi résidu nahan sipat biokimia aslina maranéhanana, résidu Arg160 penting dina IZUMO1 diganti ku Asp148 boga muatan négatip di SPACA6;studi saméméhna geus ditémbongkeun yén mutasi Arg160Glu di IZUMO1 ampir sakabéhna abolishes mengikat JUNO43.Sajaba ti éta, bédana dina orientasi domain antara IZUMO1 na SPACA6 nyata ngaronjat aréa permukaan situs JUNO-mengikat wewengkon sarua dina SPACA6 (Gbr. S14g).
Sanaos peryogi SPACA6 pikeun fusi gamét sareng kasaruaan sareng IZUMO1, SPACA6 henteu katingalina gaduh fungsi beungkeutan JUNO anu sami.Ku alatan éta, kami geus narékahan pikeun ngagabungkeun data struktural urang jeung bukti pentingna disadiakeun ku biologi évolusionér.Sekuen alignment of SPACA6 homologues nembongkeun konservasi struktur umum saluareun mamalia.Contona, sésa-sésa sistein aya malah dina amfibi nu patali jauh (Gbr. 6a).Ngagunakeun server ConSurf, sababaraha runtuyan alignment data ingetan tina 66 runtuyan anu dipetakeun kana beungeut SPACA6.Jenis analisis ieu tiasa nunjukkeun résidu mana anu disimpen nalika évolusi protéin sareng tiasa nunjukkeun daérah permukaan mana anu maénkeun peran dina fungsina.
a alignment runtuyan SPACA6 ectodomains ti 12 spésiés béda disiapkeun ngagunakeun CLUSTAL OMEGA.Numutkeun kana analisis ConSurf, posisi paling konservatif ditandaan biru.Sistein sésa disorot beureum.Wates domain sareng elemen struktur sekundér dipidangkeun di luhur alignment, dimana panah nunjukkeun β-strands sareng gelombang nunjukkeun hélik.Identifier Aksés NCBI anu ngandung runtuyan nyaéta: manusa (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), monyét capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), kuda (Equus caballus, XPr52_0202_2007), kuda (Equus caballus, XP_02_02rca3, 306_02_02_02_01_2015) 3 XP_032_034).), domba (Ovis aries, XP_014955560), gajah (Loxodonta africana, XP_010585293), anjing (Canis lupus familyis, XP_025277208), beurit (Mus musculus, NP_001156381), Tascophilus _06381), Tascophilus _06381, Tascophilus_036381, Tascophilus_036381 ypus, 8) , 61_89 jeung Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Panomeran dumasar kana urutan manusa.b Perwakilan permukaan struktur SPACA6 kalawan 4HB di luhur jeung domain Ig-kawas di handap, kelir dumasar kana perkiraan konservasi ti server ConSurf.Bagian anu paling diawetkeun nyaéta warna bulao, bagian anu sedeng dilestarikan aya dina warna bodas, sareng anu pangsaeutikna dilestarikan dina warna konéng.sistein ungu.Tilu patches permukaan demonstrating tingkat luhur panyalindungan ditémbongkeun dina inset dilabélan patch 1, 2 jeung 3. Kartun 4HB ditémbongkeun dina inset katuhu luhur (skéma warna sarua).
Struktur SPACA6 boga tilu wewengkon permukaan kacida conserved (Gbr. 6b).Patch 1 ngawengku 4HB sarta wewengkon hinge sarta ngandung dua conserved sasak disulfida CXXC, hiji Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 jaringan hinge (Gbr. S7), sarta tilu résidu aromatik luar conserved (Phe31, Tyr73, Phe137)).a pasisian lega tina domain Ig-kawas (Gbr. S6e), nu ngagambarkeun sababaraha résidu muatan positif dina beungeut spérma.Narikna, patch ieu ngandung hiji epitope antibodi nu saméméhna geus ditémbongkeun ngaganggu fungsi SPACA6 30.Wewengkon 3 ngawengku hinge jeung hiji sisi domain kawas Ig;wewengkon ieu ngandung prolines conserved (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) jeung kaluar-nyanghareup polar / résidu muatan.Ahéng, lolobana résidu dina beungeut 4HB kacida variabel (Gbr. 6b), najan tilep ieu conserved sakuliah SPACA6 homolog (sakumaha dituduhkeun ku conservatism tina inti kebat hidrofobik) sarta saluareun superfamili IST.
Sanajan ieu wewengkon pangleutikna di SPACA6 kalawan elemen struktur sekundér pangsaeutikna bisa didéteksi, loba sésa-sésa wewengkon hinge (kaasup wilayah 3) anu kacida conserved diantara homologs SPACA6, nu bisa nunjukkeun yén orientasi tina kebat hélik jeung β-sandwich muterkeun hiji peran.salaku konservatif.Sanajan kitu, sanajan beungkeutan hidrogén éksténsif jeung jaringan éléktrostatik di wewengkon hinge of SPACA6 na IZUMO1, bukti kalenturan intrinsik bisa ditempo dina alignment tina sababaraha struktur diwenangkeun tina IZUMO137,43,44.Alignment tina domain individu tumpang tindih ogé, tapi orientasi tina domain relatif ka silih variatif ti 50 ° nepi ka 70 ° ti sumbu sentral (Gbr. S16).Pikeun ngartos dinamika konformasi SPACA6 dina leyuran, percobaan SAXS dilakukeun (Gbr. S17a, b).Ab initio rekonstruksi ectodomain SPACA6 conformed kana struktur kristal rod (Gbr. S18), sanajan plot Kratky némbongkeun sababaraha gelar tina kalenturan (Gbr. S17b).Konformasi ieu kontras jeung IZUMO1, nu protéin unbound nganggap wangun boomerang boh dina kisi jeung dina leyuran43.
Pikeun husus ngaidentipikasi wewengkon fléksibel, hidrogén-deuterium bursa massa spéktroskopi (H-DXMS) dipigawé dina SPACA6 tur dibandingkeun jeung data saméméhna dicandak dina IZUMO143 (Gbr. 7a, b).SPACA6 jelas leuwih fleksibel ti IZUMO1, sakumaha dituduhkeun ku bursa deuterium luhur sakuliah struktur sanggeus 100.000 s bursa.Dina duanana struktur, bagian C-terminal wewengkon hinge nembongkeun tingkat luhur bursa, nu meureun ngamungkinkeun rotasi kawates 4HB na Ig-kawas domain relatif ka silih.Narikna, bagian C-terminal tina hinge SPACA6, diwangun ku résidu 147CDLPLDCP154, mangrupakeun wewengkon kacida conserved 3 (Gbr. 6b), jigana nunjukkeun yén kalenturan interdomain mangrupa fitur évolusionér konservasi tina SPACA6.Numutkeun analisis kalenturan, CD data ngalembereh termal némbongkeun yén SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) kirang stabil ti IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (Gbr. S1e na S19).
a H-DXMS gambar tina SPACA6 jeung b IZUMO1.Persentase bursa deuterium ditangtukeun dina titik waktu anu dituduhkeun.Tingkat pertukaran hidrogén-deuterium dituduhkeun ku warna dina skala gradién ti biru (10%) ka beureum (90%).kotak hideung ngagambarkeun wewengkon bursa tinggi.Wates 4HB, hinge jeung domain kawas Ig observasi dina struktur kristal ditémbongkeun di luhur runtuyan primér.Tingkat pertukaran Deuterium dina 10 s, 1000 s, jeung 100.000 s anu plotted dina bagan strip superimposed dina surfaces molekular transparan SPACA6 na IZUMO1.Bagian tina struktur kalayan tingkat bursa deuterium handap 50% diwarnaan bodas.Wewengkon di luhur 50% bursa H-DXMS diwarnaan dina skala gradién.
Pamakéan CRISPR / Cas9 jeung mouse gén knockout strategi genetik geus ngarah ka idéntifikasi sababaraha faktor penting pikeun spérma jeung endog mengikat jeung fusi.Salian ti interaksi anu dicirian saé tina struktur IZUMO1-JUNO sareng CD9, kalolobaan protéin anu aya hubunganana sareng fusi gamét tetep sacara struktural sareng fungsional enigmatic.Karakterisasi biofisik sareng struktural SPACA6 mangrupikeun sapotong teka-teki molekular adhesion / fusi nalika fértilisasi.
SPACA6 sareng anggota superfamili IST sanés katingalina dilestarikan pisan dina mamalia ogé manuk individu, réptil, sareng amfibi;kanyataanna, eta ngira yén SPACA6 ieu malah diperlukeun pikeun fértilisasi di zebrafish 59. Sebaran ieu sarupa jeung protéin gamét pakait fusi-pakait lianna kayaning DCST134, DCST234, FIMP31, sarta SOF132, suggesting yén faktor ieu HAP2-kakurangan (ogé. katelah GCS1) protéin nu jawab aktivitas katalitik loba protista., tutuwuhan, jeung artropoda.protéin fusi dibuahan 60, 61. Sanajan kasaruaan struktural kuat antara SPACA6 na IZUMO1, knockout gén encoding salah sahiji protéin ieu nyababkeun infertility di mencit jalu, nunjukkeun yén fungsi maranéhanana dina fusi gamét teu duplicated..Leuwih lega, euweuh protéin spérma dipikawanoh diperlukeun pikeun fase adhesion fusi anu kaleuleuwihan.
Tetep patarosan kabuka naha SPACA6 (jeung anggota superfamily IST séjén) ilubiung dina simpang intergametic, ngabentuk jaringan intragametic pikeun recruit protéin penting pikeun titik fusi, atawa malah meta salaku fusogens hese dihartikeun.Studi ko-immunoprecipitation dina sél HEK293T ngungkabkeun interaksi antara IZUMO1 panjang sareng SPACA632.Sanajan kitu, ectodomains rékombinan kami henteu interaksi in vitro, suggesting yén interaksi ditempo dina Noda et al.duanana dihapus dina konstruksi (catetan buntut sitoplasma IZUMO1, nu geus ditémbongkeun teu perlu pikeun fértilisasi62).Alternatipna, IZUMO1 jeung/atawa SPACA6 bisa merlukeun lingkungan mengikat husus nu urang teu baranahan in vitro, kayaning konformasi fisiologis husus atawa kompléx molekular nu ngandung protéin séjén (dipikawanoh atawa can kapanggih).Sanajan IZUMO1 ectodomain dipercaya jadi mediasi kantétan spérmatozoa kana endog dina spasi perivitelline, tujuan ectodomain SPACA6 teu jelas.
Struktur SPACA6 nembongkeun sababaraha surfaces conserved nu bisa kalibet dina interaksi protéin-protéin.Bagian anu dilestarikan tina daérah engsel langsung caket sareng motif CXXC (ditunjukkeun Patch 1 di luhur) ngagaduhan sababaraha résidu aromatik anu nyanghareup ka luar anu sering dipatalikeun sareng interaksi hidrofobik sareng π-stacking antara biomolekul.Sisi lega tina domain Ig-kawas (wilayah 2) ngabentuk alur muatan positif jeung arg kacida conserved jeung résidu-Na, sarta antibodi ngalawan wewengkon ieu saméméhna geus dipaké pikeun meungpeuk fusi gamét 30.Antibodi ngakuan epitope linier 212RIRPAQLTHRGTFS225, anu ngagaduhan tilu tina genep résidu arginin sareng His220 anu dijaga pisan.Henteu écés naha disfungsina disababkeun ku sumbatan résidu khusus ieu atanapi sakumna daérah.Lokasi celah ieu deukeut C-terminus β-sandwich nunjukkeun cis-interaksi jeung protéin spérma tatangga, tapi teu jeung protéin oosit.Saterusna, ingetan tina prolin-euyeub tangle kacida fléksibel (situs 3) dina hinge nu bisa jadi situs interaksi protéin-protéin atawa, leuwih gampang, nunjukkeun ingetan kalenturan antara dua domain.Gender penting pikeun peran kanyahoan tina SPACA6.fusi gamét.
SPACA6 mibanda sipat protéin adhesion intercellular, kaasup β-sandwich kawas Ig.Loba protéin napel (misalna cadherins, integrins, adhesins, sarta IZUMO1) mibanda hiji atawa leuwih domain β-sandwich nu manjangkeun protéin tina mémbran sél ka target lingkungan maranéhna63,64,65.Domain kawas Ig tina SPACA6 ogé ngandung motif nu ilahar kapanggih dina β-sandwich tina adhesion jeung kohési: doublets tina untaian paralel di tungtung β-sandwich, katelah clamps mékanis66.Hal ieu dipercaya yén motif ieu ngaronjatkeun daya tahan kana gaya geser, nu berharga pikeun protéin aub dina interaksi intercellular.Sanajan kitu, sanajan kasaruaan ieu adhesins, aya ayeuna euweuh bukti yen SPACA6 berinteraksi sareng bule endog.Ectodomain SPACA6 teu bisa ngabeungkeut JUNO, sarta SPACA6-ekspresi sél HEK293T, ditémbongkeun saperti di dieu, boro berinteraksi sareng oosit kurang zona 32.Lamun SPACA6 teu nyieun beungkeut intergametic, interaksi ieu bisa merlukeun modifikasi pos-translasi atawa stabilisasi ku protéin spérma séjén.Pikeun ngadukung hipotésis anu terakhir, spérmatozoa kakurangan IZUMO1 meungkeut oosit, nunjukkeun yén molekul lian ti IZUMO1 kalibet dina léngkah adhesi gamét 27.
Seueur protéin fusi virus, sélular, sareng pamekaran gaduh sipat anu ngaduga fungsina salaku fusogens.Contona, glikoprotein fusi virus (kelas I, II jeung III) boga péptida fusi hidrofobik atawa loop di tungtung protéin nu diasupkeun kana mémbran host.Peta hydrophilicity of IZUMO143 jeung struktur (ditangtukeun jeung diprediksi) tina superfamili IST némbongkeun euweuh péptida fusi hidrofobik katempo.Janten, upami aya protéin dina superfamili IST anu fungsina salaku fusogens, aranjeunna ngalakukeunana dina cara anu béda ti conto anu dipikanyaho.
Kasimpulanana, fungsi anggota superfamili IST protéin anu aya hubunganana sareng fusi gamét tetep janten misteri anu pikaresepeun.Molekul rekombinan SPACA6 kami sareng struktur anu direngsekeun bakal masihan wawasan ngeunaan hubungan antara struktur anu dibagi ieu sareng peranna dina kantétan gamét sareng fusi.
Runtuyan DNA pakait jeung ectodomain SPACA6 manusa diprediksi (nomer digentos NCBI NP_001303901.1; résidu 27-246) ieu kodon-dioptimalkeun pikeun éksprési dina sél Drosophila melanogaster S2 sarta disintésis salaku fragmén gén jeung runtuyan encoding Kozak (Eurofins Genomics)., Sinyal sékrési BiP sareng 5' sareng 3' anu saluyu pikeun kloning bebas ligasi gén ieu kana vektor ekspresi pMT dumasar kana promoter metallothionein anu dirobih pikeun seleksi sareng puromycin (pMT-puro).Vektor pMT-puro ngodekeun situs pembelahan thrombin dituturkeun ku tag C-terminal 10x-Na (Gambar S2).
Transfection stabil tina véktor SPACA6 pMT-puro kana sél D. melanogaster S2 (Gibco) dipigawé sarupa jeung protokol dipaké pikeun IZUMO1 na JUNO43.S2 S2 anu thawed sarta tumuwuh dina sedeng Schneider urang (Gibco) supplemented kalawan konsentrasi ahir 10% (v / v) panas-inactivated sérum fétus anak sapi (Gibco) jeung 1X antibiotik antimycotic (Gibco).Sél petikan awal (sél 3,0 x 106) dilapis dina sumur individu tina plat 6 sumur (Corning).Saatos 24 jam inkubasi dina 27 ° C, sél anu transfected kalawan campuran 2 mg SPACA6 pMT-puro vektor jeung réagen transfection Effectene (Qiagen) nurutkeun protokol produsén urang.Sél anu ditransféksi diinkubasi salami 72 jam teras dipanén nganggo puromisin 6 mg / ml.Sél teras diisolasi tina médium Schneider lengkep sareng disimpen dina médium Serangga-XPRESS bébas sérum (Lonza) pikeun produksi protéin skala ageung.A 1 L angkatan kultur sél S2 ieu tumuwuh nepi ka 8-10 × 106 ml-1 sél dina 2 L ventilated polipropilén Erlenmeyer flask datar-bottomed lajeng sterilized kalawan konsentrasi ahir 500 µM CuSO4 (Millipore sigma) jeung steril disaring.ngainduksi.Budaya anu diinduksi diinkubasi dina suhu 27 ° C dina 120 rpm salami opat dinten.
Conditioned sedeng ngandung SPACA6 ieu diisolasi ku centrifugation dina 5660 × g dina 4 ° C dituturkeun ku sistem filtration aliran tangensial Centramate (Pall Corp) kalawan mémbran 10 kDa MWCO.Larapkeun médium kentel anu ngandung SPACA6 kana kolom 2 ml Ni-NTA agarose résin (Qiagen).Résin Ni-NTA dikumbah ku 10 volume kolom (CV) panyangga A lajeng 1 CV panyangga A ditambahkeun pikeun masihan konsentrasi imidazole ahir 50 mM.SPACA6 ieu eluted kalawan 10 ml panyangga A supplemented kalawan imidazole nepi ka konsentrasi ahir 500 mM.Thrombin kelas pangwatesan (Millipore sigma) ieu ditambahkeun langsung kana tubing dialysis (MWCO 12-14 kDa) dina 1 unit per mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 jeung 150 mM NaCl (panyangga B) pikeun dialisis.) dina 4°C salila 48 jam.SPACA6 anu dibeulah thrombin ieu lajeng diluted tilu kali lipat pikeun ngurangan konsentrasi uyah sarta dimuat onto a 1 ml MonoS 5/50 GL kolom bursa kation (Cytiva / GE) equilibrated kalawan 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Penukar kation dikumbah ku 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, teras SPACA6 dielusi ku gradién linier tina 0 dugi ka 500 mm NaCl dina 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 pikeun 25 OK.Saatos kromatografi bursa ion, SPACA6 ieu kentel kana 1 ml na eluted isocratically tina hiji ENrich SEC650 10 x 300 kolom (BioRad) equilibrated kalawan panyangga B. Numutkeun kromatogram nu, pool na konsentrasi fraksi ngandung SPACA6.Purity dikawasa ku éléktroforésis Coomassie-patri dina 16% SDS-polyacrylamide gél.Konsentrasi protéin diukur ku absorbance dina 280 nm ngagunakeun hukum Beer-Lambert jeung koefisien kapunahan molar teoritis.
SPACA6 dimurnikeun ieu dialisis sapeuting ngalawan 10 mM natrium fosfat, pH 7,4 jeung 150 mM NaF sarta diluted kana 0,16 mg / ml saméméh analisis ku spéktroskopi CD.Scanning spéktral CD kalayan panjang gelombang 185 ka 260 nm dikumpulkeun dina spéktropolarimeter Jasco J-1500 nganggo cuvettes quartz kalayan panjang jalur optik 1 mm (Helma) dina 25 ° C dina laju 50 nm / mnt.Spéktra CD dilereskeun dasar, rata-rata langkung ti 10 akuisisi, sareng dirobih janten ellipticity residual (θMRE) dina derajat cm2 / dmol:
dimana MW nyaéta beurat molekular unggal sampel dina Da;N nyaéta jumlah asam amino;θ nyaéta ellipticity dina milidegrees;d pakait jeung panjang jalur optik dina cm;konsentrasi protéin dina hijian.