310 10 * 1mm Stainless steel coiled tubing komponén kimiawi, The N-terminal domain spidroin ngabentuk hydrogels dumasar kana fibrils amyloid sarta nyadiakeun platform keur immobilization protéin.

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.

Spésifikasi

310 10 * 1mm Stainless steel coiled tubing suppliers

Komposisi kimiawi

Sipat mékanis

Protéin sutra lancah rékombinan (protéin sutra lancah) boga loba aplikasi poténsial dina ngembangkeun biomaterial anyar, tapi sipatna multimodal tur rawan aggregation ngajadikeun aranjeunna hésé pikeun ménta sarta gampang ngagunakeun.Di dieu urang ngalaporkeun yén protéin spidroin miniatur rékombinan sareng, anu penting, domain N-terminal (NT) sorangan gancang ngabentuk hydrogels mandiri sareng transparan dina 37 °C.protéin fusi diwangun ku NT jeung protéin fluoresensi héjo atawa purin nukléosida fosforilase ngabentuk protéin fusi fungsi pinuh.Hidrogél.Hasil kami nunjukkeun yén rékombinan NT sareng protéin fusi nyayogikeun ngahasilkeun éksprési anu luhur sareng masihan hydrogels kalayan sipat anu pikaresepeun sapertos transparansi, gelation tanpa crosslinking, sareng immobilisasi langsung protéin aktif dina dénsitas luhur.
Spiders gaduh saloba tujuh sét béda tina kelenjar sutra, unggal ngahasilkeun tipe husus tina sutra.Tujuh spésiés sutra diwangun ku protéin sutra lancah (spidroins) kira-kira 6000 résidu panjang sarta ngandung wewengkon ulang sentral badag dikurilingan ku domain buleud N- jeung C-terminal (NT jeung CT)1,2.Jinis sutra anu paling loba ditalungtik, ampulla primér, dihasilkeun ku kelenjar ampula primér.Dina kelenjar ieu, hiji monolayer sél épitél nyintésis protéin spidroin sarta secretes kana lumen kelenjar, dimana aranjeunna hadir dina bentuk leyur (doping) dina konsentrasi pisan luhur (30-50% w/v)3,4.Organisasi jeung konformasi protéin spidroin ampullar utama dina kelenjar geus didebat, tapi lolobana bukti eksperimen nunjukkeun ayana konformasi hélik umumna hélik jeung / atawa acak sarta micellar atanapi struktur lamellar5,6,7,8,9,10.Sedengkeun domain repetitive ngatur sipat mékanis serat sutra, ngabentuk β-lambar nanocrystals jeung struktur amorf11,12,13,14,15, domain tungtung ngatur serat sutra di respon kana ngarobah kaayaan sapanjang kelenjar sutra16,17,18.Ku ngadalikeun formasi sutra, 19. domain terminal anu évolusionér dilestarikan sarta fungsi maranéhanana bisa jadi umum pikeun sakabéh protéin spidroin 2,20,21.Nalika ngalangkungan kelenjar, pH spidroin turun tina sakitar 7,6 dugi ka <5,716 sareng ningkat ku geser sareng regang dimédiasi ku gerakan ngaliwatan saluran anu laun-laun narrowing.Dina leyuran, CT mangrupa α-hélik constitutive paralel dimer17, tapi respon kana pH lemah sareng gaya geser, CT unfolds sarta switch β-lapisan16, 17, jigana triggering β-lapisan di wewengkon repetitive of Convert 16. NT anu monomeric handapeun. kaayaan ngagambarkeun kaayaan dina lumen kelenjar jeung nyapih kalarutan spidroin, tapi dina ngurangan pH, protonasi sajumlah ranté samping asam karboksilat ngabalukarkeun dimerization NT kalawan pKa kira 6,5, kukituna stabilisasi NT jeung fixing spidroin dina badag. kuantitas.jaringan16,18.Ku kituna, NT muterkeun hiji peran konci dina formasi filamén, ngarobah tina monomér dina lapisan ka dimer dina serat23,24,25.NT tetep kacida leyur na hélik dina sagala kaayaan diulik nepi ka date16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, nu diideuan ngembangkeun na salaku labél kalarutan-enhancing pikeun produksi protéin hétérolog.
Protéin sutra lancah mini rékombinan, diwangun ku hiji NT, hiji wewengkon ulangan pondok, hiji CT, sarta tag His6 (His-NT2RepCT) pikeun purifikasi, larut dina panyangga cai salaku protéin sutra lancah asli sareng meniru ciri penting asli lancah sutra. .sinyalna 25.31.Nya-NT2RepCT bisa dipintal kana serat kontinyu ngagunakeun mesin biomimetic nu pH 8 palapis leyur ieu extruded kana pH 525,32,33,34,35 cai mandi.Fermentasi bioreaktor E. coli anu nganyatakeun-NT2RepCT-Na sareng saatos perlakuan saatosna ngahasilkeun hasil> 14 g / L saatos purifikasi.Hasil anu luhur, kalarutan anu luhur, sareng réspon anu nyukupan tina His-NT2RepCT kana kaayaan asam sadayana dikaitkeun kana NT23, 25, 34.
Di dieu urang ngalaporkeun kabentukna gancang hidrogél transparan tina protéin spidroin rékombinan, kaasup NT nyalira, ku inkubasi solusi protéin dina 37 °C.Ngagunakeun thioflavin T fluoresensi (ThT), Fourier transformasi spéktroskopi infra red (FTIR), nuklir résonansi magnetik spéktroskopi (NMR) jeung transmisi éléktron mikroskop (TEM), urang manggihan yén NT jeung microspider protéin ngalaman transformasi struktural kana β-lambar jeung fibrils amyloid-kawas. nalika gél kabentuk.Sajaba ti éta, protéin fusi NT jeung protéin fluoresensi héjo (GFP) atawa purin nucleoside phosphorylase (PNP) ngabentuk hydrogél kalawan fragmen fusi fungsi pinuh.Éksprési throughput anu luhur dina host hétérolog, ditambah sareng formasi hidrogél anu gancang dina kaayaan fisiologis, muka kamungkinan produksi hidrogél anu murah sareng fungsi anu direkayasa.
Teu kawas paling dilaporkeun protéin spidroin rékombinan36, His-NT2RepCT stabil dina panyangga Tris-HCl dina pH 8 sarta bisa ngumpul nepi ka 500 mg/mL tanpa présipitasi25.Ku alatan éta, urang reuwas pikeun manggihan yén protéin ieu gancang ngabentuk optik jelas, hydrogels timer ngarojong lamun inkubasi dina 37 ° C (Gbr. 1b-d).Panaliti satuluyna nunjukkeun yén gelation His-NT2RepCT lumangsung dina rupa-rupa konsentrasi protéin (10-300 mg / mL) sareng yén konsentrasi ieu dihubungkeun tibalik sareng waktos gelation (Gbr. 1c sareng Gambar Tambahan 1).Pikeun manggihan bagian mana tina His-NT2RepCT nyapih formasi hidrogel, urang lajeng nalungtik unggal domain individual sarta dina sagala rupa kombinasi ngagunakeun assay inversion flask (Gambar 1a, b).Kabéh fraksi diuji tina spidroin rékombinan kabentuk gél (dina konsentrasi protéin 300 mg / ml) dina waktu kirang ti 1 h, iwal precipitated 2Rep (Gbr. 1b).Ieu nunjukkeun yen NT jeung CT nyalira, dina kombinasi, atawa pakait sareng repeats, tiasa gél dina 37 ° C sarta yén tag His6 henteu mangaruhan prosés ieu ka extent signifikan wae.Dibikeun anggapan umum yén NT mangrupikeun protéin anu larut pisan sareng stabil, sareng yén laporan saméméhna ngeunaan hydrogels spidroin rékombinan parantos ngahubungkeun éfék gelation kana parobahan konformasi di daérah ulangan sareng / atanapi CT, NT sorangan tiasa.Kapanggihna gelation teu kaduga.Tambahan Table 1) 37, 38, 39. Luar biasa, NT geus gelled dina 10 menit dina konsentrasi ≥ 300 mg / mL (Gbr. 1c).Percobaan inversion vial kalawan rupa-rupa konsentrasi NT némbongkeun yén dina> 50 mg / ml solusi NT gelled leuwih gancang ti His-NT2RepCT dina konsentrasi pakait (w / v, Gambar 1c).
Répréséntasi skéma tina rupa-rupa konstruksi spidroin anu diulik dina karya ieu.b Waktu gél dina 37 °C pikeun rupa-rupa protéin spidroin rékombinan (300 mg/mL) diverifikasi ku inverting vial.CT gél geuwat tanpa inkubasi (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, skala 5 mm).c waktos gél His-NT2RepCT na NT dina konsentrasi protéin dituduhkeun dina 37 ° C.d Foto-foto His-NT2RepCT sareng NT hydrogels sareng lancah sareng hurup "NT" dicitak di handapna masing-masing (duanana 200 mg / mL, skala bar 5 mm).
Hydrogels dibentuk ku rupa protéin spidroin rékombinan boga warna rada béda, sarta observasi mata taranjang nembongkeun varying derajat transparansi (Gbr. 1b).NT gél luar biasa jelas bari gél séjén jadi opak.Na-NT2RepCT na nt gél tuang kana tabung cylindrical bisa dikaluarkeun tina kapang gembleng (Gbr. 1d).
Pikeun nguji naha gél coatings sutra lancah alam dina kaayaan kiwari kapanggih ngabalukarkeun gelation tina protéin spidroin rékombinan, coatings dikumpulkeun tina kelenjar ampulla badag tina lancah jembatan Swedia (Larinioides sclopetarius).Lapisan disimpen dina panyangga 20 mM Tris-HCl dina 50 mg / mL (dumasar kana beurat garing anu diukur), tapi henteu aya gelasi anu dititénan salami 21 dinten inkubasi dina 37 ° C (Suplemén Gambar 2a).
Pikeun ngitung gél ieu, pangukuran rhéologis tiasa dianggo pikeun ngulik prosés gelasi sareng nangtukeun sipat mékanis sadayana.Khususna, ngawaskeun modulus panyimpen (élastisitas) dina suhu anu luhur tiasa masihan inpormasi ngeunaan suhu gelling ogé sipat viscoelastic tina lapisan éta.Ékspérimén naékna suhu (ngagunakeun 1 ° C / mnt dina 25-45 ° C, dumasar kana panilitian saacanna nganggo solusi stok sutra alami) 40,41 nunjukkeun yén moduli panyimpen solusi His-NT2RepCT sareng NT ningkat kalayan ningkatna suhu.ieu ngaronjat (Gbr. 2 jeung Gbr. Suplemén. 3).Utamana, modul NT mimiti tumuwuh dina suhu anu langkung handap dibandingkeun His-NT2RepCT, konsisten sareng waktos gél anu langkung gancang dititénan nalika NT langsung diinkubasi sareng His-NT2RepCT dina 37 ° C (Gambar 1).Saatos turunna suhu salajengna, modulus panyimpen henteu balik deui ka nilai anu langkung handap sareng tetep di luhur modulus leungitna (tingali Gambar Tambahan 3), nunjukkeun gelation stabil anu teu tiasa dibalikkeun sacara termal.Saatos gelation, modulus elastis ahir antara 15 dugi ka 330 kPa pikeun hidrogél His-NT2RepCT dina konsentrasi 100-500 mg / mL, sareng modulus elastis akhir pikeun hidrogél NT (100-500 mg / mL) berkisar antara 2 dugi ka 1400. kPa (Gbr., 2 jeung data tanjakan lengkep) tingali Suplemén Gbr. 3).
a Parobahan suhu salila pangukuran His-NT2RepCT (300 mg/mL) jeung b NT (300 mg/mL) kalawan oyag.Panah nunjukkeun trend suhu, sarta shading torek tina data modul gudang depicts nguji dina nilai torsi handap pikeun instrumen ti dieusian ku produsén, nu ngabalukarkeun ngaronjatna noise.c Akumulasi modul tungtung-Na-NT2RepCT sareng NT saatos suhu luhur (100, 300, sareng 500 mg / mL).Sadaya bacaan modul dicandak dina frékuénsi 0,1 Hz.
Salaku metodeu poténsial pikeun nalungtik parobahan konformasi anu aya hubunganana sareng gelation, kami ngarékam spéktrum FTIR of His-NT2RepCT sareng NT sateuacan sareng saatos gelation dina 37 ° C (Gambar 3a, b).Sapertos anu dipiharep, spéktra solusi His-NT2RepCT sareng NT pakait sareng protéin anu nunjukkeun α-helix / struktur sekundér coil acak, kalayan pita anu diucapkeun dina 1645 cm-1.Pikeun duanana hydrogels, gelation nyababkeun formasi dua leungeun dina pita tengah I kira-kira 1617 cm-1 jeung 1695 cm-1 (Gbr. 3a, b), nunjukkeun formasi antiparallel struktur β-lambar.Parobahan ieu ogé bisa jelas katempo dina turunan kadua masing-masing jeung spéktra gelation bédana (Suplemén Gbr. 4b).Dua pita lapisan β NT langkung jelas tibatan His-NT2RepCT, nunjukkeun yén total eusi pita lapisan β dina hidrogél NT langkung luhur tibatan hidrogél NT2RepCT.
spéktra nyerep FTIR His-NT2RepCT sareng b NT (duanana 500 mg/mL) sateuacan (solusi) sareng saatos inkubasi (gél) dina 37 ° C.c gambar TEM of resuspended 50 mg / ml NT2RepCT gél jeung d NT.Skala bar 200 nm.e Serat diaméterna His-NT2RepCT na NT hydrogels.n = 100 fibrils diukur, p <0,0001.Bar kasalahan nunjukkeun simpangan baku.Puseur bar kasalahan nyaéta mean.Tés-t anu teu berpasangan (dua buntut) digunakeun pikeun analisis statistik.f ThT fluoresensi rupa-rupa protéin spidroin rékombinan (100 mg/mL) dina 37 °C tanpa oyag.g NT (100 mg/mL) percobaan inokulasi tina 100 mg/mL NT gél kalawan 0%, 5%, 10%, jeung 20% ​​siki.
Analisis gél ngagunakeun transmisi éléktron mikroskop (TEM) némbongkeun yén hidrogél diwangun ku fibrils amyloid-kawas (Gbr. 3c, 3d).Fibrils kabentuk NT anu elongated (diaméterna 5-12 nm) jeung unbranched, sedengkeun fibrils His-NT2RepCT éta pondok panjangna tur nyata lega diaméterna (7-16 nm) (Gbr. 3e).Hasil ieu ngamungkinkeun urang pikeun nuturkeun kinétika fibrosis ngagunakeun thioflavin T (ThT) assay.Pikeun sakabéh protéin spidroin rékombinan, sinyal fluoresensi ngaronjat nalika sampel anu incubated dina 37 ° C (Gbr. 3f, Suplemén Gbr. 5a).Konsisten jeung Pananjung ieu, pamariksaan mikroskopis NT jeung His-NT2RepCT dina kaayaan gelling wangsit kanaékan seragam dina fluoresensi ThT tanpa akumulasi lokal noticeable tina agrégat ThT-positip (Suplemén Gbr. 5b, c).Kabentukna fibrils ThT-positip teu dibarengan ku paningkatan dina NT jeung Na-NTCT turbidity (Suplemén Gbr. 5d), nu hartina jaringan fibrils dina gél bisa ngabentuk tanpa compromising kajelasan gél.Seeding ku nambahkeun jumlah leutik fibrils pre-kabentuk nyata bisa ngagancangkeun formasi fibril sababaraha amyloids42,43,44 tapi nambahkeun 5%, 10% atawa 20% (w/w) NT kana leyuran hydrocoagulants NT.pangaruh seeding (Gbr. 3g).Panginten ieu kusabab kanyataan yén fibril dina hidrogél rélatif tetep sareng henteu tiasa dianggo salaku siki.
Paripolah anu teu kaduga tina protéin spidroin rékombinan dina suhu anu luhur nyababkeun studi spéktroskopi résonansi magnetik nuklir (NMR) salajengna pikeun ngaidentipikasi parobahan konformasi anu aya hubunganana sareng formasi gél.spéktra NMR solusi His-NT2RepCT kacatet kana waktu dina 37 ° C némbongkeun yén CT masih sawaréh narilep, sedengkeun sinyal NT jeung 2Rep geus ngiles (Gbr. 4a), nunjukkeun yén éta utamana NT jeung 2Rep nu sawaréh dikawasa formasi His- Hidrogél NT2RepCT.Sinyal CT ogé atenuasi kana 20% tina inténsitas aslina, nunjukkeun yén CT ogé biasana tetep sareng dilebetkeun kana struktur hidrogél.Pikeun bagian leutik tina CT, nu sakumaha mobile sakumaha dina sampel preincubated sahingga dititénan ku solusi NMR, spéktra kakurangan sinyal pikeun 10 résidu terstruktur munggaran, kamungkinan alatan immobilization hésé tina porsi napel His-NT2Rep.Spéktrum NMR tina -state of hydrogels -NT2RepCT ngungkabkeun ayana dominan α-héliks jeung β-lapisan jeung, ka extent Lesser, konformasi coil acak (Gbr. 4b).Analisis shift kimiawi résidu methionine ngan aya dina NT némbongkeun yén domain ieu geus dirobah jadi struktur β-lambar.Spéktra NT-gumantung waktos dina leyuran némbongkeun panurunan seragam dina inténsitas sinyal (Gbr. 4c), sarta NMR solid-state of NT hydrogels némbongkeun yén lolobana résidu NT dirobah jadi struktur β-lambar (Gbr. 4d).Konformasi 2Rep teu bisa ditangtukeun misah alatan kacenderungan na agrégat.Sanajan kitu, spéktra NMR kaayaan padet tina NTCT na His-NT2RepCT hydrogels kasampak pisan sarupa (Gbr. 4b; Suplemén Gbr. 6b), nunjukkeun yen 2Rep nyumbang saeutik kana bagian struktural tina hydrogel His-NT2RepCT.Pikeun CT hydrogels, α-héliks, β-lambar, jeung struktur sekundér hélik acak kapanggih aya (Suplemén Gbr. 6d).Ieu nunjukkeun yén sababaraha bagian tina CT tetep α-héliks sedengkeun anu sanésna janten β-lambar.Ku kituna, hasil spéktroskopi NMR nunjukkeun yén NT penting pikeun formasi hidrogél sarta ogé robah jadi konformasi β-lambar nalika fusi sareng 2Rep sareng CT.Konsisten jeung ieu, urang nembe kapanggih yén amyloid zippers spasial kamungkinan ngabentuk dina sakabéh lima helices tina domain NT, sarta algoritma Waltz diprediksi wewengkon amyloidogenic dina helix 1 (Gbr. 4e).
Spéktra 2D of 15N-HSQC 10 mg/mL larutan His-NT2RepCT saméméh (biru) jeung 19 jam sanggeus inkubasi (beureum) dina 37 ° C.Puncak cross individu dina spéktrum beureum sareng F24, G136, polyA dina spéktrum biru dilambangkeun ku simbol asam amino hurup tunggal sareng nomer résidu.Insets nunjukkeun gumantungna inténsitas sinyal dina waktosna pikeun résidu anu dipilih tina domain NT, 2Rep, sareng CT.b spéktrum radiofrequency solid-state (RFDR) tina hidrogél His-NT2RepCT.Korélasi résidu Cα/Cβ anu dititénan dina spéktrum RFDR ditangtukeun ku ngabandingkeun jeung parobahan kimia péptida modél jeung niléy anu diturunkeun tina statistik82,83 jeung struktur sékundérna.SSB - puteran sideband.c spéktra hiji diménsi 15N-HSQC 10 mg/mL larutan NT salila inkubasi dina 37 °C salila 36 jam.Inset nunjukkeun inténsitas volumetrik versus waktos.d spéktra RFDR kaayaan padet tina hidrogél NT.Korélasi résidu Cα / Cβ sareng struktur sékundérna dititénan dina spéktra RFDR dituduhkeun.e Dumasar kana profil propensity fibrillation NT45.79 ti database Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Énergi Rosetta tina jandela shift kilat spasial tina héksapéptida ditémbongkeun dina kcal/mol.Bar beureum ngalambangkeun héksapéptida kalayan kacenderungan fibrosis anu luhur (énergi Rosetta handap -23 kcal/mol; handap garis dotted).Bar héjo nunjukkeun serpihan sareng énergi Rosetta di luhur ambang sareng ku kituna kamungkinan henteu ngabentuk seleting sterik.Fragmén anu ngandung prolin dikaluarkeun tina analisis (tanpa kolom).Kuadrat nunjukkeun wewengkon amyloidosis diprediksi ku Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Runtuyan résidu asam amino NT aya di luhur, sareng jinis résidu anu aya dina struktur sékundér β (ditetepkeun ku spéktroskopi NMR kaayaan padet) dipidangkeun beureum.Posisi lima NT α-héliks ditunjuk salaku (H1-H5)28.
Dina pH <6,5, HT dimerizes, tahan ka panas- atawa uréa-ngainduksi denaturasi18.Pikeun ngajelaskeun kumaha dimerisasi sareng stabilitas NT mangaruhan gelation, solusi anu ngandung 100 mg / ml NT dikontrol dina pH 8, 7, sareng 6 nganggo uji inversi vial.sampel NT incubated dina pH 8 jeung 7 gelled sanggeus 30 mnt dina 37 ° C, tapi pH 8 gél tetep jelas, sedengkeun pH 7 gél némbongkeun endapanan katempo (Gbr. 5a).Sabalikna, solusi anu ngandung HT dina pH 6 henteu ngabentuk gél, sareng éndapan anu ageung tiasa katingali saatos 20 menit dina suhu 37 ° C.Ieu nunjukkeun yén dimer sorangan jeung / atawa stabilitas maranéhanana leuwih luhur dibandingkeun monomér nyegah gelation.Kabentukna endapan pikeun NT dina pH 7 sareng 6 henteu disangka-sangka, sabab dilaporkeun yén NT larut dina 200 mg / ml27, gampang refolds saatos denaturasi panas, sareng ogé nahan α-helix dina nilai anu langkung handap. pH 18. Penjelasan probable pikeun discrepancies ieu nya éta percobaan dilaporkeun saméméhna dilaksanakeun dina suhu kamar atawa handap, atawa dina konsentrasi protéin rélatif low16,18,19.
Uji inversi vial NT (100 mg/mL) dina pH 8, 7, 6 sareng 154 mM NaCl (pH 8) saatos inkubasi dina 37 ° C.b spéktra CD NT kalayan sareng tanpa 154 mM NaF sareng 154 mM NaCl, masing-masing.Ellipticity molar dina 222 nm dirobah jadi proporsi tilep alam.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C jeung 60 °C), NTA72R (37 °C), jeung His-NT-L6 (37 °C jeung 60 °C).d spéktra CD mutan NT NT*, NTA72R, sarta His-NT-L6.Ellipticity molar dina 222 nm dirobah jadi proporsi tilep alam.e Uji inversi NTFlSp, NTMiSp sareng ngurangan NTMiSp (100 mg/mL).Skala bar 5 mm.f CD spéktra NT, NTFlSp, NTMiSp jeung ngurangan NTMiSp.Ellipticity molar dina 222 nm dirobah jadi proporsi tilep alam.Spéktra NT lengkep dina 25 °C sareng 95 °C dipidangkeun dina Gambar Tambahan 8.
Konsentrasi uyah fisiologis nangtukeun interaksi éléktrostatik antara subunit NT jeung dimerization transfer NT ka pH handap 18.Kami mendakan yén ayana 154 mM NaCl sareng NaF leres-leres ngahambat gelation masing-masing (Gbr. 5a, b; Gbr. Tambahan 2b) sareng yén uyah ieu ningkat stabilitas termal monomér NT (Gbr. 5b, Gbr. 8). .Éta ogé nunjukkeun yén paningkatan stabilitas, tinimbang dimerisasi, nyegah pembentukan gél.
Pikeun ngajalajah deui peran dimerisasi protéin sareng stabilitas dina gelasi, kami nganggo dua mutan, NT * sareng NTA72R, anu ogé tetep monomérik dina pH28.30 rendah.NT* nyaéta mutant ngabalikeun muatan ganda dimana distribusi muatan dipolar tina monomér diratakeun, anu nyegah dimerisasi sareng ningkatkeun stabilitas monomér sacara drastis.NTA72R mangrupakeun dipole muatan, tapi Arg-diganti Ala perenahna di wates dimer, jadi mutasi ngaganggu interaksi subunit diperlukeun pikeun dimerization.Kana inkubasi dina 37 ° C, NT * teu ngabentuk hydrogel a, bari NTA72R ngawangun hiji gél opaque pikeun 15 mnt (Gbr. 5c).Kusabab duanana NT * jeung NTA72R teu bisa dimerize tapi béda dina stabilitas monomér (Gbr. 5d), hasil ieu niatna nunjukkeun yén stabilitas termodinamika tinggi nyegah NT ti gelling.Ieu ogé dirojong ku kanyataan yén HT * ngabentuk gél nalika teu stabil dina suhu luhur (sanggeus 8 mnt dina 60 ° C; Gbr. 5c).Samemehna geus ditémbongkeun yén eusi luhur methionine dina NT liquefies tilepan alam na yén genep Patepung ka Leu substitutes (disebut didieu salaku His-NT-L6) niatna nyaimbangkeun monomér NT46.Dumasar kana anggapan yén kalenturan struktural diperlukeun pikeun formasi gél NT, urang manggihan yén mutant stabil His-NT-L6 teu gél dina 37 ° C (Gambar 5c, d).Sanajan kitu, His-NT-L6 ogé ngabentuk gél kana inkubasi dina 60 ° C pikeun 60 mnt (Gbr. 5c).
Kamampuh NT pikeun transformasi kana struktur β-lambar sareng ngabentuk hidrogél sigana dilarapkeun ka sababaraha tapi henteu sadayana domain NT spedroin.NTs tina jenis sutra béda jeung spésiés lancah, Trichonephila clavipes (NTFlSp), kabentuk gél sanajan eusi methionine rélatif low maranéhanana jeung stabilitas termal tinggi (Gbr. 5e, f jeung Table Tambahan 2).Kontras, NT ti spidroin protéin ampullar leutik ti Araneus ventricosus (NTMiSp) kalawan stabilitas termal lemah sareng eusi methionine tinggi teu ngabentuk hydrogels (Tabel Tambahan 2 jeung Gbr. 5e, f).Panungtungan bisa pakait jeung ayana beungkeut disulfida intramolekul29,47.Sacara konsisten, nalika beungkeut disulfida NTMiSp diréduksi, éta ngabentuk hidrogél saatos inkubasi dina 37 ° C salami 10 menit (Gbr. 5e).Dina kacindekan, éta kudu dicatet yén kalenturan struktural mangrupa penting, tapi teu hijina, kriteria keur formasi gél ti NT.Faktor séjén anu tiasa relevan nyaéta kacenderungan pikeun ngabentuk fibril amiloid, sareng analisa sareng pangkalan data seleting sareng algoritma Waltz nunjukkeun korelasi antara kamampuan ngabentuk gél sareng ayana daérah amyloidogenik, ogé luasna daérah anu diprediksi. pikeun ngabentuk seleting sterik.Aya korelasi (Tabel Tambahan 2 sareng Gambar Tambahan 9).
Kamampuhan NT pikeun ngabentuk fibrils sareng ngabentuk gél dina kaayaan anu nguntungkeun nyababkeun urang hipotésis yén fusi NT sareng fragmen protéin sanésna masih tiasa ngabentuk gél kalayan fungsi pinuh ku mitra fusi.Pikeun nguji ieu, kami ngenalkeun protéin fluoresensi héjo (GFP) sareng fosforilase nukléosida purin (PNP) masing-masing dina C-terminus NT.Protéin fusi anu dihasilkeun dinyatakeun dina E. coli kalayan ngahasilkeun ahir anu kacida luhurna (150 mg/L jeung 256 mg/L kultur flask goyang pikeun His-NT-GFP jeung His-NT-PNP, masing-masing), konsisten jeung naon geus ditémbongkeun. pikeun protéin séjén ngahiji jeung NT Ref.30. Na-NT-GFP (300mg / ml) jeung Na-NT-PNP (100mg / ml) protéin fusi kabentuk gél sanggeus 2 jam na 6,5 ​​jam dina 37 ° C jeung, importantly, fraksi GFP tetep unchanged.dititénan sanggeus gelation, kalawan> 70% tina inténsitas fluoresensi awal sésana sanggeus gelation (Gbr. 6a).Pikeun ngukur kagiatan PNP dina solusi sareng gél-NT-PNP-na, urang kedah éncér protéin fusi sareng NT sabab kagiatan énzimatik persiapan murni éta di luar rentang deteksi tés dina konsentrasi gelling.Gél kabentuk ku campuran ngandung 0,01 mg / mL His-NT-PNP na 100 mg / ml NT nahan 65% tina aktivitas énzimatik awal sampel preincubated (Gbr. 6b).gél tetep gembleng salila pangukuran (Suplemén Gbr. 10).
a Inténsitas fluoresensi rélatif saméméh jeung sanggeus gelation of His-NT-GFP (300 mg/mL) jeung vial inverted ngandung hydrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) dina lampu katempo jeung UV.Titik nunjukkeun ukuran individu (n = 3), bar kasalahan nunjukkeun simpangan baku.Nilai rata-rata dipidangkeun di tengah-tengah bar kasalahan.aktivitas PNP b dicandak ku analisis fluorometric ngagunakeun solusi na gél diwangun ku NT (100 mg / ml) jeung campuran ngandung 0,01 mg / ml na-NT-PNP na 100 mg / ml dollar Taiwan Anyar.Inset nembongkeun vial inverted ngandung hydrogel ngandung His-NT-PNP (5 mm skala bar).
Di dieu, urang ngalaporkeun kabentukna hydrogels tina NT jeung protéin spidroin rékombinan séjén ku incubating solusi protéin dina 37 ° C (Gambar 1).Kami nunjukkeun yén gelation pakait sareng transformasi α-héliks kana lapisan β sareng formasi fibrils amiloid-kawas (Gbr. 3 sareng 4).Papanggihan ieu héran sabab NTs mangrupakeun bundles globular lima héliks dipikawanoh pikeun kalarutan kacida luhurna jeung stabilitas tinggi dina konsentrasi> 200 mg/mL dina 4 ° C salila sababaraha poé27.Sajaba ti éta, NTs gampang refold sanggeus denaturasi panas dina konsentrasi protéin low dina µM.Numutkeun hasil kami, formasi fibril merlukeun kombinasi> 10 mg / ml konsentrasi protéin jeung hawa rada elevated (Gbr. 1).Ieu saluyu jeung pamanggih yén amiloid fibrils bisa ngabentuk tina globularly narilep protéin nu aya dina kaayaan sawaréh unfolded alatan fluctuations termal dina kaayaan fisiologis 48 .Conto protéin anu ngalaman konvérsi ieu kalebet insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin sareng lisozim51,52,53.Sanajan NT mangrupa α-héliks dina kaayaan asalna, kira-kira 65% tina ranté polipéptida cocog jeung formasi seleting sterik (Gbr. 4e) 45 .Kusabab monomér sacara dinamis mobile46, éta tiasa ngalaan daérah amyloidogenik poténsial ieu dina suhu anu rada luhur sareng dina konsentrasi luhur protéin total tiasa ngahontal konsentrasi kritis pikeun formasi fibril amiloid54.Saatos penalaran ieu, kami mendakan korelasi négatip antara konsentrasi spidroin sareng waktos gelation (Gbr. 1c), sareng upami konformasi NT monomérik distabilkeun boh ku mutasi (NT*, His-NT-L6) atanapi ku tambahan uyah, tiasa nyegah hydrogels formasi (Gbr. 5).
Dina kalolobaan kasus, fibrils amyloid ngaleungit tina solusi salaku endapanana, tapi dina kaayaan nu tangtu maranéhna bisa ngabentuk hydrogels55,56,57.Fibrils ngabentuk hidrogél biasana gaduh rasio aspék anu luhur sareng ngabentuk jaringan tilu diménsi anu stabil ngaliwatan entanglement molekular, 55,58 konsisten sareng hasil urang.Pikeun formasi hidrogél in vitro, protéin mindeng pinuh atawa sawaréh unfolded, contona, ku paparan pangleyur organik, suhu luhur (70-90 ° C) jeung/atawa low pH (1,5-3,0) 59,60,61,62.Hidrogél spidroin anu dijelaskeun di dieu henteu meryogikeun pamrosésan anu parah, sareng henteu peryogi agén panyambung silang pikeun nyaimbangkeun hidrogél.
Samemehna geus dilaporkeun yén spidroin repeats na QDs, nu kaciri ngalaman switching β-lambar salila spinning sutra, ngabentuk hydrogels.Dibandingkeun sareng papanggihan urang, waktos inkubasi sareng / atanapi suhu inkubasi sacara signifikan langkung panjang atanapi langkung luhur, masing-masing, sareng hidrogél anu hasilna sering opak (Gambar 7 sareng Tabél Tambahan 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Salian waktos gél gancang, hydrogels NT> 300 mg / mL (30%) outperformed sakabeh séjén digambarkeun hydrogels protéin sutra lancah rekombinan, kitu ogé hydrogels alam kayaning gelatin, alginate (2%), agar (0,5 % ) jeung kolagén.(0,6%) (Gambar 7 jeung Tables Suplemén 1 jeung 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Waktu gél jeung modulus elastis tina hydrogels dina ulikan ieu dibandingkeun kalawan hydrogels dumasar-spidroin sejen tur hydrogels alam dipilih.Rujukan dipasihkeun sareng pedaran ngeunaan kaayaan gelasi.APS Amonium persulfate, suhu kamar.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Laba-laba sigana parantos ngembangkeun cara pikeun nyegah spidroin tina gelling nalika neundeun.Sanajan konsentrasi luhur protéin dina kelenjar sutra, wewengkon ulang badag pakait sareng domain terminal hartina konsentrasi katempo NT jeung CT dina kelenjar pakait jeung kira 10-20 mg / ml, dina wates ulikan ieu.diperlukeun pikeun in vitro formasi hydrogel observasi.Sajaba ti éta, konsentrasi sarupa uyah 16 stabilized NT, sakumaha dina kelenjar sutra (Gbr. 5b).Konformasi NT geus ditalungtik dina sitosol E. coli sarta kapanggih leuwih pageuh narilep ti nalika nalungtik in vitro, salajengna nunjukkeun yén uyah atawa faktor séjén nyegah aggregation na in vivo.Sanajan kitu, kamampuh NTs pikeun transformasi kana β-lambar fibrils bisa jadi penting pikeun formasi filamén sarta kudu ditalungtik dina studi hareup.
Salian aspék novél NT-amyloid-kawas fibril sarta formasi hydrogel observasi dina ulikan ieu, urang ogé némbongkeun yén fenomena ieu bisa mibanda aplikasi biotéhnologis jeung biomedis (Gbr. 8).Salaku bukti konsép, kami ngagabungkeun NT sareng GFP atanapi PNP sareng nunjukkeun yén protéin fusi ogé ngabentuk hidrogél nalika diinkubasi dina 37 ° C sareng yén fraksi GFP sareng PNP umumna nahan kagiatanana saatos gelasi (Gambar 6).Fosforilase nukléosida mangrupa sintésis katalis penting tina analog nukléosida75, nu ngajadikeun pamanggihan urang relevan pikeun industri biofarmasi.Konsep nganyatakeun protéin fusi anu ngabentuk hydrogels transparan dina kaayaan nguntungkeun ngamungkinkeun kreasi hydrogels functionalized mibanda sipat nguntungkeun pikeun rupa-rupa aplikasi kayaning immobilization énzim, sékrési ubar dikawasa jeung rékayasa jaringan.Salaku tambahan, NT sareng NT* mangrupikeun pananda éksprési anu éfisién30, anu hartosna NT sareng varian na tiasa dianggo pikeun produksi protéin fusi larut anu luhur sareng nyiptakeun protéin target anu teu tiasa dianggo dina hidrogél 3D.
NT larut, α-hélik sareng stabil dina konsentrasi rendah (µM) sareng 37°C.Dina suhu nu sarua, tapi dina ngaronjatna konsentrasi (> 10 mg/ml), NT ngabentuk gél nu diwangun ku fibrils amiloid-kawas.Protéin fusi NT ogé ngabentuk gél fibrillar kalayan fragmen fusi anu fungsina pinuh, ngamungkinkeun rupa-rupa protéin pikeun diimobilisasi dina hidrogél 3D nganggo NT.Handap: NT (PDB: 4FBS) jeung ilustrasi jaringan serat jeung struktur protéin pakait (dianggap jeung teu ditarik kana skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ2 / pdb).
The constructs (tingali Suplemén Table 4 pikeun daptar lengkep kaasup runtuyan asam amino) anu diklon kana plasmid pT7 sarta robah jadi E. coli BL21 (DE3).E. coli ngandung plasmid direkayasa anu inokulasi dina kaldu Luria supplemented kalawan kanamycin (70 mg / l) sarta tumuwuh sapeuting dina 30 ° C jeung 250 rpm.Kultur teras diinokulasi 1/100 kana medium LB anu ngandung kanamisin sareng dikultur dina suhu 30°C sareng 110 rpm dugi ka OD600 ngahontal 0,8.Pikeun panilitian NMR, baktéri ditumbuhkeun dina médium minimal M9 anu ngandung 2 g D-glukosa 13C (Aldrich) sareng 1 g amonium klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) pikeun panyiri protéin sareng isotop.Turunkeun suhu nepi ka 20 darajat Celsius sarta induksi éksprési protéin kalawan 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (konsentrasi ahir).Saatos éksprési protéin sapeuting, sél dipanén dina 7278 × g, 4 ° C pikeun 20 mnt.Pelet sél ditunda deui dina 20 mM Tris-HCl, pH 8, sareng beku dugi ka dianggo salajengna.Sél anu dilebur dilisiskeun nganggo disruptor sél (mesin séri TS, Constant Systems Limited, Inggris) dina 30 kPa.Lajeng lysates disentrifugasi dina 25.000 g salila 30 menit dina 4 ° C.Pikeun NTMiSp, pellet ieu lajeng resuspended dina 2 M uréa, 20 mM Tris-HCl, pH 8, sarta sonicated pikeun 2 mnt (2 s on / off, 65%), lajeng centrifuged deui dina 25.000 xg, 4 ° C. jero. 30 mnt.Supernatan ieu dimuat kana kolom Ni-NTA, dikumbah ku 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, sarta ahirna protéin ieu eluted kalawan 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Pikeun ngahasilkeun NT2RepCT jeung NTCT, nyerna thrombin ngawanohkeun situs (ThrCleav) antara Na jeung NT.Situs pembelahan thrombin ogé aya dina His-NT-ThrCleav-2Rep (ngahasilkeun 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ngahasilkeun NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ngahasilkeun CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ngahasilkeun NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (ngahasilkeun NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ngahasilkeun NTF1Sp), sarta His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ngahasilkeun NTMiSp).The constructs anu dicerna kalawan thrombin (1: 1000) sarta dialisis sapeuting dina 4 ° C. kalawan 20 mM Tris-HCl, pH 8, ngagunakeun mémbran dialisis Spectra / Por kalawan bangbarung beurat molekul 6-8 kDa.Sanggeus dialisis, leyuran dimuat kana kolom Ni-NTA jeung efluent ngandung protéin dipikaresep dikumpulkeun.Konséntrasi protéin ditangtukeun ku cara ngukur absorbance UV dina 280 nm ngagunakeun koefisien kapunahan unggal protéin, iwal NTF1Sp, nu ngagunakeun assay Bradford nurutkeun protokol produsén urang.Purity ditangtukeun ku SDS polyacrylamide (4-20%) gél éléktroforésis jeung Coomassie cemerlang staining biru.Protéin dikonsentrasikeun nganggo saringan centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) dina 4000 xg kalayan potongan beurat molekul 10 kDa dina siklus 20 menit.
Ngalembereh leyuran protéin jeung taliti pipet 150 µl kana 1 ml vial septum jelas (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tabung ditutupan sareng disegel ku parafilm pikeun nyegah évaporasi.Sampel (n = 3) diinkubasi dina 37 ° C atanapi 60 ° C sareng périodik dibalikkeun pikeun niténan gelation.Sampel anu henteu gél diinkubasi sahenteuna saminggu.Ngurangan beungkeut disulfida NTMiSp ku 10 mM DTT per 10 µM protéin.Pikeun nganalisis gelation of coatings sutra lancah alam, lancah sasak Swedia ieu motong, dua kelenjar ampullated utama disimpen dina 200 μl 20 mM Tris-HCl panyangga pH 8 sarta motong pikeun ngidinan lapisan pikeun misahkeun tina kelenjar..Eusi kelenjar leyur dina panyangga, 50 µl pikeun nangtukeun beurat garing (ku inkubasi vials kabuka dina 60 °C nepi ka beurat konstan) jeung 150 µl pikeun gelation dina 37 °C.
Géométri / alat ukur didamel tina stainless steel nganggo piring paralel kalayan diaméter luhur 20 mm sareng jurang 0,5 mm.Panaskeun sampel tina 25 °C nepi ka 45 °C jeung balik deui ka 25 °C dina laju 1 °C per menit ngagunakeun stainless steel handap plat Peltier.Pangukuran geter dilaksanakeun dina frékuénsi 0,1 Hz sareng di daérah viscoelastic linier bahan dina galur 5% sareng 0,5% pikeun conto masing-masing 100 mg / mL sareng 300-500 mg / mL.Anggo kamar kalembaban khusus pikeun nyegah évaporasi.Data dianalisis ngagunakeun Prisma 9.
Pikeun ngumpulkeun spéktra infra red (IR) dina suhu kamar ti 800 nepi ka 3900 cm–1.Alat ATR, kitu ogé jalur cahaya ngaliwatan spéktrométer, dimurnikeun ku hawa disaring garing saméméh jeung salila percobaan.Leyuran (500 mg/mL pikeun ngaleutikan puncak nyerep cai dina spéktra) anu pipetted onto kristal, sarta gél (500 mg/mL) kabentuk saméméh pangukuran lajeng dipindahkeun ka kristal (n = 3).1000 scan dirékam kalawan resolusi 2 cm-1 jeung nol siklus tugas 2. Turunan kadua diitung ngagunakeun OPUS (Bruker) ngagunakeun rentang smoothing salapan titik.Spéktra dinormalisasi ka wewengkon integrasi sarua antara 1720 jeung 1580 cm-1 maké F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Dina spéktroskopi ATR-IR, jero penetrasi sinar infra red kana sampel gumantung kana jumlah gelombang, hasilna nyerep leuwih kuat dina wilangan gelombang anu leuwih handap ti batan angka gelombang anu leuwih luhur.Épék ieu teu acan dilereskeun pikeun spéktra anu dipidangkeun dina Gbr.3 sabab leutik pisan (Suplemén Gbr. 4).spéktra dilereskeun pikeun inohong ieu diitung ngagunakeun software Bruker OPUS.
Sacara prinsip, hiji kuantitas komprehensif konformasi protéin mungkin sanggeus deconvolution dipercaya tina komponén dina amide I puncak.Sanajan kitu, sababaraha halangan timbul dina prakna.Noise dina spéktrum bisa muncul salaku puncak (palsu) salila deconvolution.Sajaba ti éta, puncak alatan bending cai coincides jeung posisi puncak amida I sarta bisa boga gedena sarupa pikeun sampel ngandung jumlah badag cai, kayaning gél cai diajarkeun di dieu.Ku alatan éta, urang teu nyobian sagemblengna decompose amida I puncak, sarta observasi urang ngan kudu dianggap ngarojong métode séjén kayaning spéktroskopi NMR.
Solusi 50 mg / ml NT sareng His-NT2RepCT digentos sapeuting dina suhu 37 ° C.Hidrogél tuluy éncér jeung 20 mM Tris-HCl (pH 8) nepi ka konsentrasi 12,5 mg/ml, dikocok ogé sarta dipipet pikeun megatkeun gél.Salajengna, hidrogél ieu éncér 10 kali kalayan 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl sampel diterapkeun kana grid tambaga anu dilapis ku formvar, sareng kaleuwihan sampel dipiceun ku kertas blotting.Sampel dikumbah dua kali sareng 5 µl cai MilliQ sareng diwarnaan ku format uranil 1% salami 5 menit.Leupaskeun kaleuwihan noda ku kertas absorbent, lajeng hawa garing bolong.Imaging ieu dipigawé dina grids ieu ngagunakeun hiji FEI Tecnai 12 Roh BioTWIN operasi di 100 kV.Gambar dirékam dina x 26.500 jeung x 43.000 magnifications maké kaméra Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Jérman).Pikeun unggal sampel (n = 1), 10-15 gambar dirékam.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) dipaké pikeun analisis gambar jeung pangukuran diaméter serat (n = 100, serat béda).Prisma 9 dipaké pikeun ngalakukeun tés-t teu berpasangan (dua buntut).Rata-rata fibril His-NT2RepCT sareng NT nyaéta 11.43 (SD 2.035) sareng 7.67 (SD 1.389) nm, masing-masing.Interval kapercayaan (95%) nyaéta -4,246 nepi ka -3,275.darajat kabébasan = 198, p <0,0001.
80 µl sampel cair ngandung 10 µM thioflavin T (ThT) diukur dina rangkep tilu (n = 3) dina kaayaan statik maké Corning 96-sumur hideung handap lempeng jelas handap (Corning Glass 3881, AS).Beda fluoresensi dirékam nganggo saringan éksitasi 440 nm sareng saringan émisi 480 nm (FLUOStar Galaxy ti BMG Labtech, Offenburg, Jérman).Sinyal ThT henteu jenuh atanapi pareum, sabab ékspérimén kalayan konsentrasi ThT anu béda-béda dilakukeun tanpa ngarobih inténsitas sinyal.Catet nyerep dina 360 nm pikeun pangukuran halimun.Pikeun percobaan seeding, 100 mg/mL gél kabentuk dina 37 ° C, resuspended, sarta dipaké pikeun seeding dina babandingan molar 5%, 10%, jeung 20%.Data dianalisis ngagunakeun Prisma 9.
Ngalembereh stok His-NT2RepCT sareng NT> 100 mg/mL dina és teras saring ngaliwatan saringan 0,22 µm.Konsentrasi diitung ku cara ngukur absorbansi dina 280 nm ngagunakeun Nanodrop.Dina sumur tina 96-sumur plat hideung non-mengikat (Corning) kalawan handap jelas, sampel diluted nepi ka 20 mg/ml dina 20 mM Tris-HCl pH 8 jeung dicampurkeun jeung 5 μM ThT (konsentrasi ahir), total konsentrasi sampel. volume 50 μl.Sampel digambar unggal 10 menit dina 37 ° C dina mikroskop CellObserver (Zeiss) kalayan saluran cahaya anu dikirimkeun sareng set éksitasi sareng émisi FITC pikeun pencitraan ThT.Lénsa 20x/0.4 dipaké pikeun pencitraan.Zen Blue (Zeiss) jeung ImageJ (https://imagej.nih.gov/) dipaké pikeun analisis gambar.Gél ogé disiapkeun tina solusi NT sareng His-NT2RepCT dina konsentrasi 50 mg / mL anu ngandung 20 mM Tris pH 8 sareng 5 µM ThT sareng diinkubasi dina 37 ° C salami 90 menit.Potongan gél ditransferkeun ka sumur anyar anu ngandung 20 mM Tris, pH 8, sareng 5 μM ThT dina piring dasar sumur 96 hideung anu teu ngariung.Kéngingkeun fluoresensi héjo sareng gambar lapangan anu terang dina pembesaran 20x / 0,4.ImageJ dipaké pikeun analisis gambar.
Solusi spéktra NMR dicandak dina 310 K dina spéktrométer 600 MHz Bruker Avance Neo dilengkepan QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Sampel NMR ngandung 10 mg/mL protéin homogen dilabélan ku 13C, 15N, leyur dina 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Pergeseran kimiawi NT2RepCT dina pH 6.7 digunakeun pikeun nangtukeun puncak 23 dina spéktrum 2D 15N-HSQC.
Sudut magic spinning spéktra NMR solid (MAS) 13C, 15N-dilabélan hydrogels kacatet dina spéktrométer Bruker Avance III HD dina 800 MHz dilengkepan usik 3,2 mm 13C / 15N {1H} éléktron.hawa sampel ieu dikawasa ngagunakeun aliran gas hawa variabel dina 277 K. Dua diménsi dipole rotational résonansi (DARR) 76 sarta reconnection frékuénsi radio (RFDR) 77 spéktra anu kaala dina frékuénsi MAS 12,5 kHz jeung 20 kHz, mungguh.Polarisasi silang (CP) tina 1H ka 13C dilaksanakeun nganggo tanjakan linier tina 60,0 dugi ka 48,0 kHz dina 1H, 61,3 / 71,6 kHz dina 13C (dina 12,5 / 20 kHz MAS) sareng waktos kontak 0,5-1 ms.Spinal6478 decoupling dina 73,5 kHz dipaké nalika ngumpulkeun data.Waktu akuisisi éta 10 milliseconds jeung reureuh siklus éta 2,5 detik.Korélasi Cα/Cβ numbu tunggal anu dititénan dina spéktra RFDR ditugaskeun dumasar kana pergeseran kimiawi tipe résidu karakteristik jeung korélasi multiply-numbu dina spéktra DARR.
Database Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) digunakeun pikeun ngaevaluasi tendensi flutter sareng énergi Rosetta pikeun NT, NTFlSp, sareng NTMiSp.Database Zipper ngitung Rosetta Energy80, anu ngagabungkeun sababaraha fungsi énergi bébas pikeun modél sareng nganalisa struktur protéin.Tingkat énergi -23 kcal / mol atanapi langkung handap nunjukkeun kacenderungan anu luhur pikeun fibrilasi.Énergi handap hartina leuwih stabilitas dua β-untaian dina konformasi seleting.Sajaba ti éta, algoritma Waltz dipaké pikeun ngaduga wewengkon amyloidogenic di NT, NTFlSp jeung NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Solusi protéin NT dicampurkeun sareng panyangga 2-(N-morpholino) asam etanasulfonat (MES) dina pH 5,5 sareng 6,0 pikeun nurunkeun pH masing-masing ka pH 6 sareng 7.Konsentrasi protéin ahir nyaéta 100 mg / ml.
Pangukuran dilakukeun dina spéktrométer CD J-1500 (JASCO, AS) nganggo cuvette 300 μL kalayan jalur optik 0,1 cm.Protéin éncér kana 10 μM (n = 1) dina panyangga fosfat 20 mM (pH 8).Pikeun nganalisis stabilitas protéin dina ayana uyah, protéin dianalisis dina konsentrasi sarua (n = 1) dina 20 mM fosfat panyangga (pH 8) ngandung 154 mM NaF atawa NaCl, mungguh.Scan suhu dirékam dina 222 nm ti 25 ° C nepi ka 95 ° C kalayan laju pemanasan 1 ° C / mnt.Proporsi protéin narilep asli diitung ngagunakeun rumus (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Salaku tambahan, lima spéktrum dirékam pikeun tiap sampel tina 260 nm dugi ka 190 nm dina 25 ° C sareng saatos pemanasan dugi ka 95 ° C.Lima spéktrum rata-rata, dihaluskeun sareng dirobih kana ellipticity molar.Data dianalisis ngagunakeun Prisma 9.
Inténsitas fluoresensi His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) diukur dina rangkep tilu (n = 3) dina pelat Corning 96-sumur kalayan handap transparan hideung (Corning Glass 3881, AS) dina kaayaan statik.Ukur sampel nganggo pamaca plat dumasar fluoresensi kalayan panjang gelombang éksitasi 395 nm sareng rekam émisina dina 509 nm sateuacan gelation sareng 2 jam saatos dina 37 ° C.Data dianalisis ngagunakeun Prisma 9.
Kit assay aktivitas fosforilase nukléosida purin (metode fluorometric, Sigma Aldrich) dianggo nurutkeun parentah produsén.Pikeun ngukur aktivitas dina gél jeung larutan nu ngandung His-NT-PNP, campur 10 ng His-NT-PNP jeung 100 mg/mL NT nepi ka volume total 2 µL sabab gél méré sinyal di luhur interval deteksi set.Kontrol pikeun gél sareng solusi tanpa-NT-PNP kalebet.Pangukuran dilaksanakeun dua kali (n = 2).Saatos kagiatan diukur, campuran réaksi dipiceun sareng gél dipoto pikeun mastikeun yén gél tetep gembleng salami pangukuran.Data dianalisis ngagunakeun Prisma 9.
Kanggo inpo nu langkung lengkep ihwal desain ulikan, tingali abstrak ulikan alam numbu ka artikel ieu.
Gambar 1 jeung 2 nampilkeun data awal.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, jeung 6, Gbr tambahan.3, Gbr tambahan.5a, d, tambahan Gbr.6 jeung Gbr tambahan.8. Data Data tina ulikan ieu hosted dina database Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Data NMR diala dina ulikan ieu dipasang kana gudang BMRGig handapeun entri ID bmrbig36.Struktur GFP sareng PNP dicandak tina PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. jeung Johansson, J. Spinning sutra lancah jieunan.Kimia Nasional.biologi.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.Génom Nephila clavipes nyorot keragaman gén sutra lancah sareng éksprési kompleksna.Genette Nasional.49, 895-903 (2017).