304 Stainless steel dilas coiled tube / tubing zhemical zomponent, Poténsi Biosintétik tina Global Marine Microbiome

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Sliders némbongkeun tilu artikel per slide.Paké tombol pungkur jeung hareup pikeun mindahkeun ngaliwatan slides, atawa tombol controller slide dina tungtung pikeun mindahkeun ngaliwatan unggal slide.

Katerangan produk lengkep

304 Stainless steel dilas coiled tube / tubing
1. spésifikasi: stainless steel coil tube / tubing
2. Tipe: dilas atanapi seamless
3. Standar: ASTM A269, ASTM A249
4. stainless steel coil tube OD: 6mm mun 25.4MM
5. Panjangna: 600-3500MM atanapi sakumaha per sarat customer urang.
6. Tembok ketebalan: 0.2mm mun 2.0mm.

7. kasabaran: OD: +/-0.01mm;Kandel: +/- 0,01%.

8. Coil ukuran liang jero: 500MM-1500MM (bisa disaluyukeun nurutkeun sarat customer)

9. jangkungna Coil: 200MM-400MM (bisa disaluyukeun nurutkeun sarat customer)

10. Beungeut: Caang atanapi annealed
11. Bahan: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, alloy 625, 825, 2205, 2507, jsb.
12. Packing: tas anyaman bisi kai, Usuk kai, aci kai, atawa sakumaha per sarat customer urang
13. Test: komponén kimiawi, kakuatan ngahasilkeun, kakuatan tensile, pangukuran karasa
14. Jaminan: Inspeksi pihak katilu (contona: SGS TV), jsb.
15. Aplikasi: Hiasan, jati, transportasi minyak, exchanger panas, pembuatan railing, pembuatan kertas, mobil, ngolah dahareun, médis, jsb

Komunitas mikroba alami sacara filogenetik sareng métabolik beragam.Salian ti grup organisme1 anu teu dikaji, karagaman ieu ogé boga potensi anu beunghar pikeun kapanggihna énzim sareng sanyawa biokimiawi sacara ékologis sareng biotéhnologis.Tapi, ngulik karagaman ieu pikeun nangtukeun jalur génomik anu nyintésis sanyawa sapertos kitu sareng ngabeungkeut kana host masing-masing tetep tangtangan.Potensi biosintétik mikroorganisme di sagara kabuka tetep teu dipikanyaho ku sabab keterbatasan dina analisa data résolusi génom dina skala global.Di dieu, urang ngajalajah karagaman sareng karagaman gugus gén biosintétik di sagara ku ngahijikeun kira-kira 10,000 génom mikroba tina sél berbudaya sareng sél tunggal sareng langkung ti 25,000 draf génom anu énggal direkonstruksi tina langkung ti 1,000 conto cai laut.Usaha ieu ngaidentipikasi kira-kira 40.000 gugus gén biosintétik putative lolobana anyar, sababaraha di antarana geus kapanggih dina gugus filogenetik nu teu kaduga saméméhna.Dina populasi ieu, kami ngaidentipikasi garis keturunan anu beunghar ku gugus gén biosintétik ("Candidatus Eudormicrobiaceae") anu kalebet dina filum baktéri anu henteu dibudidayakeun sareng kalebet sababaraha mikroorganisme anu paling rupa-rupa biosintétik dina lingkungan ieu.Tina ieu, kami parantos dicirikeun jalur fosfatase-péptida sareng pytonamide, ngaidentipikasi conto struktur sanyawa bioaktif anu teu biasa sareng énzimologi, masing-masing.Dina kacindekan, ulikan ieu nunjukkeun kumaha strategi basis microbiome tiasa ngaktifkeun éksplorasi énzim anu henteu dijelaskeun sateuacana sareng katuangan alami dina mikrobiota sareng lingkungan anu kirang kahartos.
Mikroba ngadorong siklus biogéokimia global, ngajaga ramat pangan, sareng ngajaga pepelakan sareng sasatoan séhat5.Keragaman filogenetik, métabolik sareng fungsionalna anu ageung ngagambarkeun poténsi anu beunghar pikeun mendakan taksa1 anyar, énzim sareng sanyawa biokimia, kalebet produk alami6.Dina komunitas ékologis, molekul ieu nyadiakeun mikroorganisme jeung rupa-rupa fungsi fisiologis jeung ékologis, ti komunikasi jeung kompetisi 2, 7 .Salian fungsi aslina, produk alam ieu sareng jalur produksi anu disandi sacara genetik masihan conto pikeun aplikasi biotéhnologi sareng terapi2,3.Idéntifikasi jalur sareng sambungan sapertos kitu parantos difasilitasi pisan ku diajar mikroba berbudaya.Tapi, studi taksonomi lingkungan alam geus nembongkeun yen lolobana mikroorganisme teu acan dibudidayakan8.Bias budaya ieu ngabatesan kamampuan urang pikeun ngamangpaatkeun karagaman fungsional anu disandi ku seueur mikroba4,9.
Pikeun ngatasi watesan ieu, kamajuan téhnologis dina dékade katukang ngamungkinkeun para panalungtik pikeun langsung (ie, tanpa budaya saméméhna) runtuyan fragmen DNA mikroba ti sakabéh komunitas (metagenomics) atawa sél tunggal.Kamampuhan pikeun ngumpul fragmen ieu kana fragmen génom anu langkung ageung sareng ngarekonstruksikeun sababaraha génom anu dirakit sacara metagénomik (MAGs) atanapi génom amplified tunggal (SAGs), masing-masing muka kasempetan anu penting pikeun kajian taksonéntrik mikrobiom (nyaéta komunitas mikroba sareng mikrobiom).naratas jalan anyar.bahan genetik sorangan dina lingkungan nu tangtu) 10,11,12.Mémang, studi panganyarna geus greatly dimekarkeun ngagambarkeun filogenetik tina diversity mikroba on Earth1, 13 sarta geus ngungkabkeun loba diversity fungsional dina komunitas mikroba individu teu saméméhna katutupan ku mikroorganisme berbudaya reference génom sequences (REFs)14.Kamampuhan pikeun nempatkeun karagaman fungsional anu teu acan kapendak dina kontéks génom inang (nyaéta, résolusi génom) penting pisan pikeun ngaramalkeun garis mikroba anu teu acan dikarakterisasikeun anu sigana nyandikeun produk alami anyar15,16 atanapi pikeun ngalacak sanyawa sapertos kitu deui ka produsén aslina17.Salaku conto, pendekatan analisis génomik metagénomik sareng sél tunggal parantos nyababkeun idéntifikasi Candidatus Entotheonella, sakelompok baktéri anu aya hubunganana bolu métabolik, salaku produsén rupa-rupa poténsi ubar18.Sanajan kitu, sanajan usaha panganyarna dina éksplorasi génomik rupa-rupa komunitas mikroba,16,19 leuwih ti dua per tilu data metagénomic global pikeun sagara pangbadagna di Bumi tina ékosistem16,20 masih leungit.Ku kituna, sacara umum, potensi biosintétik tina microbiome laut jeung poténsi na salaku gudang novel énzimatik jeung produk alam tetep lolobana understudied.
Pikeun ngajalajah poténsi biosintétik mikrobiom laut dina skala global, urang mimiti ngumpulkeun génom mikroba laut anu diala nganggo metode anu gumantung kana budaya sareng non-budaya pikeun nyiptakeun database éksténsif ngeunaan filogenetik sareng fungsi gen.Pamariksaan databés ieu ngungkabkeun rupa-rupa gugus gén biosintétik (BGCs), anu kalolobaanana kagolong kana kulawarga gugus gén anu teu acan dikarakterisasi (GCF).Salaku tambahan, kami ngaidentipikasi kulawarga baktéri anu teu dipikanyaho anu nunjukkeun karagaman BGC anu paling dipikanyaho di sagara kabuka dugi ka ayeuna.Kami milih dua jalur sintésis ribosom sareng péptida anu dirobih post-translationally (RiPP) pikeun validasi ékspérimén dumasar kana bédana genetikna tina jalur anu ayeuna dipikanyaho.Karakterisasi fungsional jalur ieu ngungkabkeun conto énzimologi anu teu disangka-sangka ogé sanyawa anu teu biasa sacara struktural kalayan kagiatan ngahambat protease.
Mimitina, kami narékahan pikeun nyiptakeun sumber data global pikeun analisa génom, fokus kana komponén baktéri sareng archaeal na.Pikeun tujuan ieu, urang pooled data metagénomic jeung 1038 sampel seawater ti 215 situs sampling disebarkeun global (rentang lintang = 141,6 °) jeung sababaraha lapisan jero (tina 1 nepi ka 5600 m di jero, ngawengku zona pelagic, mesopelagic jeung abyssal).Background21,22,23 (Gbr. 1a, data ngalegaan, Gbr. 1a sareng Tabel Tambahan 1).Salian nyadiakeun cakupan géografis anu lega, sampel anu disaring sacara selektif ieu ngamungkinkeun urang pikeun ngabandingkeun rupa-rupa komponén mikrobiom laut, kalebet beunghar virus (<0.2 µm), anu beunghar ku prokariot (0.2–3 µm), anu beunghar partikel (0.8 µm). ).-20 µm) sareng koloni anu dileungitkeun virus (> 0,2 µm).
a, Jumlahna aya 1038 génom sadia masarakat awam (metagenomics) komunitas mikroba laut dikumpulkeun ti 215 lokasi disebarkeun global (62 ° S nepi ka 79 ° N sarta 179 ° W mun 179 ° E.).Kotak peta © Esri.Sumber: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, sareng Esri.b, metagenom ieu dipaké pikeun ngarekonstruksikeun MAGs (metode jeung émbaran tambahan), nu béda dina kuantitas jeung kualitas (metode) dina datasets (ditandaan dina warna).MAG anu direkonstruksi ditambah ku génom anu sayogi umum (éksternal), kalebet MAG26 buatan tangan, SAG27 sareng REF.27 Nyusun OMD.c, dibandingkeun laporan saméméhna ukur dumasar kana SAG (GORG) 20 atanapi MAG (GEM) 16, OMD ngaronjatkeun characterization génomik komunitas mikroba laut (metagenomic maca laju pemetaan; métode) ku dua nepi ka tilu kali kalawan ngagambarkeun leuwih konsisten dina jero tur lintang..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, > 60 °, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD ngagolongkeun kana tingkat klaster spésiés (95% mean identitas nukléotida) nangtukeun jumlahna kira-kira 8300 spésiés, leuwih ti satengahna teu saméméhna geus dicirikeun nurutkeun annotations taksonomi ngagunakeun GTDB (versi 89) e, klasifikasi spésiés dumasar tipe génom némbongkeun yén MAG, SAG na REFs ngalengkepan silih ogé dina reflecting diversity phylogenetic of mikrobiom laut.Khususna, 55%, 26% sareng 11% spésiésna khusus pikeun MAG, SAG sareng REF masing-masing.BATS, Bermuda Atlantik Time Series;GEM, génom tina microbiome Bumi;GORG, génom rujukan sagara global;HOT, Samudra Hawaii runtuyan waktu.
Ngagunakeun dataset ieu, urang rekonstruksi jumlahna aya 26.293 MAGs, lolobana baktéri jeung archaeal (Gbr. 1b jeung data dimekarkeun, Gbr. 1b).Kami nyiptakeun MAG ieu tina majelis tina conto metagénomik anu misah tinimbang pooled pikeun nyegah runtuhna variasi runtuyan alam antara sampel ti lokasi béda atawa titik waktu (metode).Salaku tambahan, kami ngagolongkeun fragmen génomik dumasar kana korélasi Prévalénsina dina sajumlah ageung conto (tina 58 dugi ka 610 conto, gumantung kana survey; metode).Kami mendakan yén ieu mangrupikeun léngkah24 anu nyéépkeun waktos tapi penting anu dilewatan dina sababaraha karya rekonstruksi MAG16, 19, 25 skala ageung sareng sacara signifikan ningkatkeun kuantitas (rata-rata 2,7 kali lipat) sareng kualitas (rata-rata + 20%) tina génom.rekonstruksi tina metagenome laut diajar di dieu (data ngalegaan, Gbr. 2a jeung émbaran tambahan).Gemblengna, usaha ieu nyababkeun kanaékan 4,5 kali ganda dina MAG mikroba laut (6 kali lipat lamun ukur MAG kualitas luhur dianggap) dibandingkeun jeung sumberdaya MAG panghadena sadia kiwari16 (Metode).MAG set karek dijieun ieu lajeng digabungkeun jeung 830 leungeun-ngangkat MAG26s, 5969 SAG27s na 1707 REFs.Dua puluh tujuh spésiés baktéri laut jeung archaea diwangun ku kumpulan combinatorial 34.799 génom (Gbr. 1b).
Urang teras ngevaluasi sumber daya anu nembé diciptakeun pikeun ningkatkeun kamampuan ngawakilan komunitas mikroba laut sareng meunteun dampak tina ngahijikeun jinis génom anu béda.Rata-rata, urang manggihan yén éta nyertakeun kira 40-60% data metagénomic laut (Gambar 1c), dua nepi ka tilu kali sinyalna laporan MAG-hijina saméméhna dina duanana jero tur lintang More serial 16 atanapi SAG20.Salaku tambahan, pikeun sacara sistematis ngukur karagaman taksonomi dina kumpulan anu ditetepkeun, kami ngémutan sadayana génom nganggo toolkit (metode) Génom Taxonomy Database (GTDB) sareng ngagunakeun identitas nukléotida rata-rata génom 95%.28 pikeun ngaidentipikasi 8.304 klaster spésiés (spésiés).Dua per tilu spésiés ieu (kaasup clades anyar) teu saméméhna muncul dina GTDB, nu mana 2790 kapanggih maké MAG rekonstruksi dina ulikan ieu (Gbr. 1d).Sajaba ti éta, urang manggihan yén tipena béda génom anu kacida pelengkap: 55%, 26%, jeung 11% spésiés diwangun sagemblengna tina MAG, SAG, sarta REF, mungguh (Gbr. 1e).Sajaba ti éta, MAG katutupan sagala 49 jenis kapanggih dina kolom cai, bari SAG na REF ngan digambarkeun 18 jeung 11 sahijina, mungguh.Sanajan kitu, SAG hadé ngagambarkeun diversity of clades paling umum (data dimekarkeun, Gbr. 3a), kayaning Pelagic Bacteriales (SAR11), kalawan SAG ngawengku ampir 1300 spésiés jeung MAG ngan 390 spésiés.Utamana, REF jarang tumpang tindih sareng MAG atanapi SAG dina tingkat spésiés sareng ngawakilan> 95% tina kira-kira 1000 génom anu henteu kapendak dina set metagénomik sagara kabuka anu ditaliti di dieu, utamina kusabab interaksi sareng jinis spésimén laut anu terasing (contona sédimén). .atawa host-asosiasi).Sangkan sadia lega ka masarakat ilmiah, sumberdaya génom laut ieu, nu ogé ngawengku fragmen unclassified (misalna ti prédiksi fag, pulo génom, sarta fragmen génom nu teu cukup data pikeun rekonstruksi MAG), bisa dibandingkeun jeung data taksonomi. .Aksés anotasi sareng fungsi gén sareng parameter kontekstual dina Pangkalan Data Mikrobiologi Samudra (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Urang teras angkat pikeun ngajalajah kabeungharan sareng kabaruan poténsi biosintétik dina mikrobiom sagara kabuka.Pikeun tujuan ieu, urang mimiti nganggo antiSMASH pikeun sadaya MAGs, SAGs, sareng REFs kapanggih dina 1038 metagénomes laut (metode) pikeun ngaduga jumlahna aya 39,055 BGCs.Urang teras dikelompokkeun ieu kana 6907 GCF anu henteu kaleuleuwihan sareng 151 populasi klaster gén (GCCs; Suplemén Tabel 2 sareng metode) pikeun ngitung redundansi alamiah (nyaéta, BGC anu sami tiasa disandikeun dina sababaraha génom) sareng data metagénomik Fragméntasi BGCs kentel.BGC anu teu lengkep henteu ningkat sacara signifikan, upami aya (Émbaran Tambahan), jumlah GCF sareng GCC, masing-masing, ngandung sahenteuna hiji anggota BGC anu utuh dina 44% sareng 86% kasus.
Dina tingkat GCC, urang kapanggih rupa-rupa diprediksi RiPPs jeung produk alam séjén (Gbr. 2a).Diantarana, contona, arilpolyén, karotenoid, ektoin, sareng siderofor kagolong kana GCCs kalayan distribusi filogenetik anu lega sareng kalimpahan anu luhur dina metagénomes samudra, anu tiasa nunjukkeun adaptasi lega mikroorganisme kana lingkungan laut, kalebet résistansi kana spésiés oksigén réaktif, stress oksidatif jeung osmotic..atawa nyerep beusi (informasi leuwih).Diversity fungsional ieu kontras jeung analisis panganyarna ngeunaan 1.2 juta BGCs diantara kira 190.000 génom disimpen dina database NCBI RefSeq (BiG-FAM / RefSeq, hereinafter disebut RefSeq) 29, nu némbongkeun yén nonribosomal Synthetase péptida (NRPS) jeung polyketide synthase. (PKS) BGCs (Émbaran Tambahan).Kami ogé mendakan 44 (29%) GCC ngan ukur aya hubunganana sareng RefSeq BGC (\ (\ bar {d} \) RefSeq> 0.4; Gbr. 2a sareng metode) sareng 53 (35%) GCC ngan dina MAG, nyorot poténsial. pikeun ngadeteksi bahan kimia anu henteu dijelaskeun sateuacana dina OMD.Kusabab masing-masing GCC ieu sigana ngawakilan fungsi biosintétik anu rupa-rupa pisan, kami teras nganalisis data dina tingkat GCF dina usaha pikeun nyayogikeun grup BGC anu langkung rinci anu diprediksi bakal kode pikeun produk alami anu sami29.Jumlahna aya 3861 (56%) GCF anu diidentifikasi henteu tumpang tindih sareng RefSeq, sareng> 97% tina GCF henteu aya dina MIBiG, salah sahiji basis data panggedéna BGC anu disahkeun sacara ékspériméntal (Gambar 2b).Sanaos henteu heran mendakan seueur jalur novél poténsial dina setélan anu henteu diwakilan ku génom rujukan, metode kami pikeun nyéépkeun BGC kana GCF sateuacan benchmarking bénten ti laporan saméméhna 16 sareng ngamungkinkeun urang pikeun masihan penilaian anu teu bias ngeunaan novelty.Seuseueurna karagaman anyar (3012 GCF atanapi 78%) pakait sareng terpenes anu diprediksi, RiPP atanapi produk alami anu sanés, sareng kalolobaanana (1815 GCF atanapi 47%) disandikeun dina jinis anu teu dipikanyaho kusabab poténsi biosintétikna.Beda sareng klaster PKS sareng NRPS, BGCs kompak ieu kurang kamungkinan bakal fragméntasi nalika majelis metagénomik 31 sareng ngamungkinkeun karakterisasi fungsional anu langkung seueur waktos sareng sumber daya produkna.
Jumlahna aya 39.055 BGC dikelompokkeun kana 6.907 GCF sareng 151 GCC.a, ngagambarkeun data (internal éksternal).Klaster hirarki jarak BGC dumasar kana GCC, 53 diantarana dibenerkeun ku MAG wungkul.GCC ngandung BGCs tina taksa béda (frekuensi Gerbang ln-transformasi) jeung kelas BGC béda (ukuran bunderan pakait jeung frékuénsi na).Pikeun unggal GCC, lapisan luar ngagambarkeun jumlah BGC, Prévalénsi (persentase sampel), jeung jarak (jarak kosinus BGC minimum (mnt(dMIBiG))) ti BiG-FAM ka BGC.GCCs kalawan BGCs raket patalina jeung BGCs diverifikasi ékspériméntal (MIBiG) disorot ku panah.b Ngabandingkeun GCF kalawan diprediksi (BiG-FAM) jeung ékspériméntal disahkeun (MIBiG) BGCs, kapanggih 3861 anyar (d-> 0,2) GCFs.Kalolobaan (78%) tina kode ieu pikeun RiPP, terpenes, sarta produk alam putative lianna.c, kabéh génom di OMD kapanggih dina 1038 metagénomes laut disimpen dina tangkal dasar GTDB pikeun nembongkeun sinyalna filogenetik OMD.Clades tanpa génom di OMD ditémbongkeun dina warna abu.Jumlah BGC pakait jeung jumlah pangbadagna BGCs diprediksi per génom dina clade dibikeun.Pikeun kajelasan, 15% panungtungan tina titik nu rubuh.Panah nunjukkeun clades anu beunghar ku BGC (> 15 BGC), iwal ti Mycobacterium, Gordonia (kadua ukur Rhodococcus), sareng Crocosphaera (kadua ngan pikeun Synechococcus).d, Teu kanyahoan c.Eremiobacterota nunjukkeun karagaman biosintétik pangluhurna (indéks Shannon dumasar kana jinis produk alami).Unggal band ngawakilan génom jeung paling BGCs dina spésiésna.T1PKS, PKS tipe I, T2/3PKS, PKS tipe II jeung tipe III.
Salian kabeungharan sareng kabaruan, urang ngajalajah struktur biogeografis poténsi biosintétik mikrobiom laut.Pengelompokan sampel ku rata-rata distribusi nomer salinan GCF metagénomik (Metode) nunjukkeun yén komunitas lintang rendah, permukaan, beunghar prokariot sareng miskin virus, kalolobaanana tina permukaan atanapi cai anu langkung jero, beunghar ku terpenes RiPP sareng BGC.Kontras, polar, jero-laut, virus- jeung komunitas-euyeub partikel pakait sareng abundances luhur NRPS na PKS BGC (data dimekarkeun, Gbr. 4 jeung émbaran tambahan).Tungtungna, kami mendakan yén komunitas tropis sareng pelagic anu ditaliti saé mangrupikeun sumber terpenes énggal (Augmented Data Figure).Potensi pangluhurna pikeun PKS, RiPP sareng produk alam anu sanés (Gambar 5a kalayan data anu dimekarkeun).
Pikeun ngalengkepan ulikan kami ngeunaan potensi biosintétik mikrobioma laut, kami narékahan pikeun peta distribusi filogenetikna sareng ngaidentipikasi clades anu diperkaya BGC anyar.Pikeun tujuan ieu, urang nempatkeun génom mikroba laut kana tangkal phylogenetic baktéri jeung archaeal GTDB13 dinormalisasi sarta overlaid jalur biosynthetic putative aranjeunna encode (Gbr. 2c).Urang geus gampang kauninga sababaraha BGC-enriched clades (diwakilan ku leuwih 15 BGCs) dina sampel seawater (metode) dipikawanoh pikeun poténsi biosynthetic maranéhanana, kayaning sianobaktéri (Synechococcus) jeung baktéri Proteus, kayaning Tistrella32,33, atawa nembe katarik perhatian maranéhanana. produk alam.kayaning Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus jeung Planctomycetota34,35,36.Narikna, urang mendakan sababaraha turunan anu teu acan dijelajah dina klad ieu.Salaku conto, spésiés-spésiés anu gaduh poténsi biosintétik anu paling sugih dina phyla Planctomycetota sareng Myxococcota kalebet kana pesenan calon sareng genera anu henteu dicirian (Tabel Tambahan 3).Dihijikeun, ieu nunjukkeun yén OMD nyadiakeun aksés ka informasi filogenetik saméméhna kanyahoan, kaasup mikroorganisme, nu bisa ngagambarkeun target anyar pikeun énzim jeung kapanggihna produk alam.
Salajengna, urang dicirikeun nu BGC-enriched clade ku teu ukur cacah jumlah maksimum BGCs disandikeun ku anggotana, tapi ogé ku assessing diversity of BGCs ieu, nu ngajelaskeun frékuénsi tipena béda produk calon alam (Gbr. 2c jeung métode. )..Kami mendakan yén spésiés anu paling rupa-rupa biosintétik diwakilan ku MAG baktéri anu direkayasa khusus dina ulikan ieu.Baktéri ieu kagolong kana filum Candidatus Eremiobacterota anu teu dibudidayakeun, anu sabagéan ageung teu acan digali salian ti sababaraha studi génomik37,38.Éta noteworthy yén "ca.Genus Eremiobacterota ngan ukur dianalisis dina lingkungan terestrial39 sareng teu dipikanyaho kalebet anggota anu beunghar dina BGC.Di dieu kami geus rekonstruksi dalapan MAGs sahiji spésiés nu sarua (idéntitas nukléotida> 99%) 23. Kituna urang ngajukeun ngaran spésiés "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", dingaranan nereid (nymph laut), kado geulis dina mitologi Yunani sarta ékspédisi.'Ka.Numutkeun annotation phylogenetic 13, E. malaspinii teu boga baraya saméméhna dipikawanoh handap tingkat runtuyan sahingga milik kulawarga baktéri anyar nu urang ngajukeun "Ca.E. malaspinii" salaku spésiés tipe sarta "Ca.Eudormicrobiaceae” salaku ngaran resmi (Inpormasi Tambahan).Rekonstruksi metagénomik ringkes 'Ca.Proyék génom E. malaspinii ieu disahkeun ku input pisan low, lila dibaca sequencing metagénomic sarta sasaran assembly of sampel tunggal (Metode) salaku tunggal 9,63 Mb kromosom linier kalawan duplikasi 75 kb.salaku hijina ambiguitas sésana.
Pikeun netepkeun kontéks filogenetik spésiés ieu, urang milarian 40 spésiés anu raket dina conto métagénomik éukariot-enriched tambahan tina ekspedisi Samudra Tara ngaliwatan rekonstruksi génom anu dituju.Sakeudeung, kami parantos ngaitkeun bacaan metagénomik kana fragmen génomik anu aya hubunganana sareng "Ca.E. malaspinii "sarta hipotésis yén laju rekrutmen ngaronjat dina sampel ieu nunjukkeun ayana baraya lianna (metode).Hasilna, urang kapanggih 10 MAG, kombinasi 19 MAG ngalambangkeun lima spésiés dina tilu genera dina kulawarga karek diartikeun (ie "Ca. Eudormicrobiaceae").Saatos inspeksi manual jeung kontrol kualitas (data dimekarkeun, Gbr. 6 jeung émbaran tambahan), kami kapanggih yén "Ca.Spésiés Eudormicrobiaceae nampilkeun génom anu langkung ageung (8 Mb) sareng poténsi biosintétik anu langkung ageung (14 dugi ka 22 BGC per spésiés) tibatan anggota "Ca" anu sanés.Clade Eremiobacterota (nepi ka 7 BGC) (Gbr. 3a-c).
a, posisi filogenetik tina lima 'Ca.Spésiés Eudormicrobiaceae némbongkeun kabeungharan BGC husus pikeun garis laut dicirikeun dina ulikan ieu.Tangkal filogenetik ngawengku sakabéh 'Ca.MAG Eremiobacterota sarta anggota phyla séjén (angka génom dina kurung) disadiakeun dina GTDB (versi 89) dipaké pikeun latar évolusionér (Metode).Lapisan pangluarna ngagambarkeun klasifikasi dina tingkat kulawarga ("Ca. Eudormicrobiaceae" jeung "Ca. Xenobiaceae") sarta dina tingkat kelas ("Ca. Eremiobacteria").Lima spésiés anu dijelaskeun dina ulikan ieu diwakilan ku kode alfanumerik sareng nami binomial anu diusulkeun (Inpormasi Tambahan).b, oke.Spésiés Eudormicrobiaceae ngabagi tujuh inti BGC umum.Henteuna BGC dina clade A2 disababkeun ku henteu lengkepna perwakilan MAG (Tabel Tambahan 3).BGCs husus pikeun "Ca.Amphithomicrobium" jeung "Ca.Amphithomicrobium" (clades A jeung B) teu ditémbongkeun.c, Sadaya BGCs disandikeun salaku "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii kapanggih dina 623 metatranscriptomes dicokot ti sagara Tara.Bunderan padet nunjukkeun transkripsi aktip.Bunderan oranyeu nunjukkeun parobahan lipetan log2-transformasi di handap sareng di luhur tingkat ekspresi gén housekeeping (metode).d, kurva kaayaanana relatif (metode) némbongkeun 'Ca.Spésiés Eudormicrobiaceae sumebar di sabagéan ageung baskom sagara sareng dina sakabéh kolom cai (tina beungeut cai nepi ka jerona sahenteuna 4000 m).Dumasar kana perkiraan ieu, urang mendakan yén 'Ca.E. malaspinii 'ngahasilkeun nepi ka 6% tina sél prokariot di laut jero-laut pelagic gandum-pakait komunitas.Urang dianggap spésiés hadir dina situs lamun kapanggih dina fraksi mana wae tina ukuran lapisan jero dibikeun.IO - Samudra Hindia, NAO - Atlantik Kalér, NPO - Pasifik Kalér, RS - Laut Beureum, SAO - Atlantik Kidul, SO - Samudra Kidul, SPO - Pasifik Kidul.
Diajar ngeunaan kaayaanana sareng distribusi Ca.Eudormicrobiaceae, nu, sakumaha urang kapanggih, predominates di lolobana basins sagara, kitu ogé dina sakabéh kolom cai (Gbr. 3d).Sacara lokal, aranjeunna ngadamel 6% tina komunitas mikroba laut, ngajantenkeun aranjeunna bagian penting tina mikrobiom laut global.Salaku tambahan, urang mendakan eusi relatif Ca.Spésiés Eudormicrobiaceae jeung tingkat éksprési BGC maranéhanana éta pangluhurna di fraksi enriched eukariot (Gbr. 3c jeung data nambahan, Gbr. 7), nunjukkeun kamungkinan interaksi jeung partikel, kaasup plankton.Observasi ieu ngasuh sababaraha kamiripan jeung 'Ca.Eudoremicrobium BGCs nu ngahasilkeun produk alam sitotoksik ngaliwatan jalur dipikawanoh bisa némbongkeun kabiasaan predator (Inpormasi Suplemén jeung Data Expanded, Gambar 8), sarupa jeung prédator séjén nu husus ngahasilkeun métabolit kayaning Myxococcus41.Papanggihan Ca.Eudormicrobiaceae dina sampel nu kurang sadia (samudra jero) atawa eukariot tinimbang prokariot bisa ngajelaskeun naha baktéri ieu jeung karagaman BGC kaduga maranéhanana tetep can écés dina konteks panalungtikan pangan alam.
Pamustunganana, urang narékahan ékspérimén pikeun ngesahkeun jangji gawé dumasar microbiome urang dina manggihan jalur anyar, énzim, jeung produk alam.Di antara kelas BGC anu béda, jalur RiPP dipikanyaho ngodekeun karagaman kimiawi sareng fungsional anu beunghar kusabab rupa-rupa modifikasi pasca-translasi inti péptida ku énzim dewasa42.Janten urang milih dua 'Ca.Eudoremicrobium 'RiPP BGCs (Angka 3b na 4a-e) dumasar kana sarua jeung sagala BGC dipikawanoh (\ (\ bar {d} \) MIBiG na \ (\ bar {d} \) RefSeq luhur 0.2).
a-c, In vitro éksprési hétérolog jeung in vitro assays énzimatik novel (\ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.29) klaster biosintésis RiPP husus pikeun spésiés Ca laut jero.E. malaspinii 'ngarah ka produksi produk diphosphorylated.c, modifikasi dicirikeun ngagunakeun-resolusi luhur (HR) MS / MS (fragméntasi dituduhkeun ku b jeung ion y dina struktur kimiawi) jeung NMR (data dimekarkeun, Gbr. 9).d, péptida phosphorylated ieu némbongkeun inhibisi micromolar low of mamalia neutrofil elastase, nu teu kapanggih dina péptida kontrol jeung péptida dehydrating ( panyabutan kimiawi ngainduksi dehidrasi).Percobaan diulang tilu kali kalayan hasil anu sami.Contona, éksprési hétérolog novél kadua \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) gugusan biosintésis protéin ngajelaskeun fungsi opat énzim asak anu ngarobih 46 péptida inti asam amino.Résidu diwarnaan dumasar kana situs modifikasi anu diprediksi ku HR-MS / MS, panyiri isotop, sareng analisa NMR (Émbaran Tambahan).Coloration dashed nunjukkeun yén modifikasi lumangsung di salah sahiji dua résidu.Angka ieu mangrupikeun kompilasi tina sababaraha konstruksi hétérolog pikeun nunjukkeun kagiatan sadaya énzim dewasa dina inti anu sami.h, Ilustrasi data NMR pikeun tulang tonggong amida N-methylation.Hasil lengkep dipidangkeun dina Gbr.10 kalawan data nambahan.abdi, posisi filogenetik énzim klaster protéin FkbM dewasa diantara sakabéh domain FkbM kapanggih dina database MIBiG 2.0 mangka hiji énzim kulawarga ieu kalawan aktivitas N-methyltransferase (Émbaran tambahan).Diagram skéma tina BGCs (a, e), struktur péptida prékursor (b, f), jeung struktur kimia putative produk alam (c, g) ditémbongkeun.
Jalur RiPP munggaran (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) ngan kapanggih dina spésiés laut jero "Ca.E. malaspinii "jeung kode pikeun péptida- prékursor (Gbr. 4a, b).Dina énzim dewasa ieu, kami parantos ngaidentipikasi domain fungsional tunggal homolog kana domain dehidrasi sintase lantipéptida anu biasana ngatalisan fosforilasi sareng ngaleungitkeun 43 (Émbaran Tambahan).Ku alatan éta, urang ngaduga yén modifikasi péptida prékursor ngalibatkeun dehidrasi dua-hambalan.Sanajan kitu, ngagunakeun spéktrometri massa tandem (MS / MS) jeung spéktroskopi résonansi magnetik nuklir (NMR), kami ngaidentipikasi hiji péptida linier polyphosphorylated (Gbr. 4c).Sanajan teu disangka-sangka, urang manggihan sababaraha garis bukti pikeun ngarojong éta produk ahir: dua sarwa hétérolog béda jeung euweuh dehidrasi in vitro assays, idéntifikasi résidu konci mutated dina situs dehidrasi katalitik énzim asak.sadayana direkonstruksi ku "Ca".The E. malaspinii génom (data dimekarkeun, Gbr. 9 jeung émbaran tambahan) jeung, tungtungna, aktivitas biologis produk phosphorylated, tapi teu formulir dehydrated disintésis kimiawi (Gbr. 4d).Kanyataanna, urang manggihan yén éta némbongkeun hiji aktivitas inhibitory protease micromolar low ngalawan elastase neutrofil, comparable jeung produk alam patali lianna dina rentang konsentrasi (IC50 = 14.3 μM) 44, sanajan kanyataan yén peran ékologis tetep elucidated.Dumasar hasil ieu, kami ngajukeun nami jalur "phospheptin".
Kasus kadua nyaéta jalur RiPP kompleks khusus pikeun 'Ca.Genus Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) diprediksi bakal encode produk protéin alam (Gbr. 4e).Jalur ieu dipikaresep ku biotéhnologi hususna kusabab kapadetan anu diperkirakeun sareng rupa-rupa modifikasi kimiawi anu teu biasa anu didamel ku énzim anu disandi ku BGCs45 anu kawilang pondok.Urang manggihan yén protéin ieu béda jeung protéin nu geus dicirian saméméhna yén éta kakurangan duanana motif NX5N utama polyceramides jeung loop lanthionine of landornamides 46.Pikeun ngatasi watesan pola éksprési hétérolog umum, kami nganggo éta sareng sistem Microvirgula aerodenitrificans khusus pikeun ngacirian opat énzim jalur dewasa (metode).Ngagunakeun kombinasi MS / MS, panyiri isotop, sarta NMR, urang ngadeteksi énzim asak ieu dina inti asam 46-amino péptida (Gbr. 4f, g, data dimekarkeun, Gbr. 10-12 sarta informasi tambahan).Diantara énzim dewasa, urang dicirikeun penampilan mimiti hiji anggota kulawarga FkbM O-methyltransferase 47 dina jalur RiPP sarta disangka kapanggih yén énzim asak ieu ngawanohkeun tulang tonggong N-methylation (Gbr. 4h, i jeung émbaran tambahan).Sanajan modifikasi ieu dipikawanoh dina produk NRP48 alam, énzimatik N-methylation beungkeut amida mangrupakeun réaksi kompléks tapi biotechnologically signifikan49 nu geus jadi dipikaresep ku kulawarga RiPP borosin.Spésifikasi 50,51.Idéntifikasi kagiatan ieu dina kulawarga séjén énzim jeung RiPP bisa muka nepi aplikasi anyar jeung ngalegaan diversity fungsional protéin 52 sarta diversity kimiawi maranéhanana.Dumasar kana modifikasi anu diidentifikasi sareng panjang anu teu biasa tina struktur produk anu diusulkeun, kami ngajukeun nami jalur "pythonamide".
Kapanggihna énzimologi anu teu kaduga dina kulawarga énzim anu dicirian sacara fungsional ngagambarkeun jangji génomik lingkungan pikeun panemuan anyar, sareng ogé ngagambarkeun kapasitas kawates pikeun inferensi fungsional dumasar kana homologi sekuen nyalira.Ku kituna, bareng jeung laporan non-canonical bioactive polyphosphorylated RiPPs, hasil kami demonstrate sumberdaya-intensif tapi nilai kritis kana usaha biologi sintétik pikeun pinuh uncover kabeungharan fungsional, diversity, sarta struktur mahiwal sanyawa biokimia.
Di dieu urang nunjukkeun jangkauan poténsi biosintétik anu disandi ku mikroba sareng kontéks génomikna dina microbiome laut global, ngagampangkeun panalungtikan kahareup ku nyayogikeun sumber daya anu dihasilkeun pikeun komunitas ilmiah (https://microbiomics.io/ocean/).Kami mendakan yén seueur novelty filogenetik sareng fungsionalna ngan ukur tiasa didapet ku ngarekonstruksikeun MAG sareng SAG, khususna di komunitas mikroba anu henteu dianggo anu tiasa nungtun usaha bioprospecting ka hareup.Sanajan urang bakal difokuskeun di dieu 'Ca.Eudormicrobiaceae" salaku katurunan utamana biosintétik "berbakat", loba BGCs diprediksi dina microbiota can kapanggih kamungkinan encode énzim saméméhna undescribed nu ngahasilkeun sanyawa jeung lampah lingkungan jeung / atawa biotéhnologis signifikan.
Dataset metagénomik tina studi oseanografi sareng séri waktos utama kalayan jero urutan anu cekap kalebet pikeun maksimalkeun cakupan komunitas mikroba laut global dina baskom sagara, lapisan jero sareng kana waktosna.Dataset ieu (Tabel Tambahan 1 sareng Gambar 1) kalebet metagenomics tina conto anu dikumpulkeun di sagara Tara (diperkayakeun virus, n = 190; prokariot diperkaya, n = 180) 12,22 sareng ekspedisi BioGEOTRACES (n = 480).Hawaiian Oceanic Time Series (panas, n = 68), Bermuda-Atlantik Time Series (BATS, n = 62)21 jeung Malaspina ekspedisi (n = 58)23.Sequencing maca tina sakabéh fragmen metagénomic disaring pikeun kualitas ngagunakeun BBMap (v.38.71) ku nyoplokkeun sequencing adapters tina dibaca, nyoplokkeun dibaca dipetakeun kana urutan kontrol kualitas (PhiX génom), sarta ngagunakeun trimq = 14, maq = 20 discards kualitas bacaan goréng, maxns = 0 sarta minlength = 45. Analisis saterusna dijalankeun atawa dihijikeun jeung QC berbunyi lamun dieusian (bbmerge.sh minoverlap = 16).Bacaan QC dinormalisasi (target bbnorm.sh = 40, minddepth = 0) sateuacan ngawangun nganggo metaSPAdes (v.3.11.1 atanapi v.3.12 upami diperyogikeun)53.Contigs scaffold anu dihasilkeun (saterusna disebut scaffolds) tungtungna disaring ku panjang (≥1 kb).
1038 sampel metagénomik dibagi kana grup, sarta pikeun tiap grup sampel, kadali kualitas metagénomic maca sakabéh sampel anu loyog jeung kurung unggal sampel misah, hasilna jumlah handap pasangan bracketed grup berbunyi: Tara Virus Kelautan - Enriched (190×190), Prokariot Enriched (180×180), BioGEOTRACES, HOT jeung BAT (610×610) jeung Malaspina (58×58).Pemetaan ieu dipigawé maké Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188) 54 nu ngidinan bacaan bisa loyog jeung situs sekundér (ngagunakeun bandéra -a).Alignments disaring janten sahenteuna 45 basa panjang, boga ≥97% identitas, sarta bentang ≥80% dibaca.Berkas BAM anu dihasilkeun diolah nganggo skrip jgi_summarize_bam_contig_depths pikeun MetaBAT2 (v.2.12.1)55 pikeun nyayogikeun sinyal intra- sareng antar-sampel pikeun unggal grup.Tungtungna, kurung dikelompokkeun pikeun ningkatkeun sensitipitas ku cara ngajalankeun MetaBAT2 masing-masing dina sadaya conto sareng -minContig 2000 sareng -maxEdges 500. Kami nganggo MetaBAT2 tinimbang petinju ensemble sabab parantos ditingalikeun dina tés mandiri janten petinju tunggal anu paling efektif.sareng 10 dugi ka 50 kali langkung gancang tibatan petinju anu biasa dianggo57.Pikeun nguji pangaruh korelasi kaayaanana, subsample metagenomics anu dipilih sacara acak (10 pikeun tiap tina dua set data Samudra Tara, 10 pikeun BioGEOTRACES, 5 pikeun unggal séri waktos, sareng 5 pikeun Malaspina) ngan ukur nganggo conto.Sampel internal dikelompokkeun pikeun kéngingkeun inpormasi cakupan.(Inpormasi Tambahan).
Génom tambahan (éksternal) anu kaasup kana analisis saterusna, nyaéta 830 MAGs dipilih sacara manual tina sawaréh tina dataset Tara Oceans26, 5287 SAGs tina dataset GORG20, sarta data tina database MAR (MarDB v. 4) ti 1707 REF terasing jeung 682 SAGs) 27. Pikeun set data MarDB, génom dipilih dumasar kana metadata sadia lamun tipe sampel cocog jeung éksprési biasa di handap ieu: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]kultur| [I|i] terasing'.
Kualitas unggal wadah metagénomic jeung génom éksternal ieu ditaksir maké CheckM (v.1.0.13) jeung Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Upami CheckM atanapi Anvi'o ngalaporkeun ≥50% kasampurnaan / kalengkepan sareng ≤10% kontaminasi / redundansi, teras simpen sél métagénomik sareng génom éksternal pikeun analisis engké.Skor-skor ieu tuluy dikombinasikeun jadi rata-rata ketuntasan (mcpl) jeung rata-rata kontaminasi (mctn) pikeun mengklasifikasikan kualitas génom nurutkeun kriteria60 masarakat saperti kieu: kualitas luhur: mcpl ≥ 90% jeung mctn ≤ 5%;kualitas alus: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, kualitas sedeng: mcpl ≥ 50% jeung mctn ≤ 10%, kualitas adil: mcpl ≤ 90% atawa mctn ≥ 10%.Génom anu disaring teras dihubungkeun sareng skor kualitas (Q sareng Q') sapertos kieu: Q = mcpl - 5 x mctn Q' = mcpl - 5 x mctn + mctn x (variability galur) / 100 + 0,5 x log [N50].(dilaksanakeun dina dRep61).
Pikeun ngidinan analisis komparatif antara sumber data béda jeung tipe génom (MAG, SAG na REF), 34.799 génom anu dereferenced dumasar kana génom-lega identitas nukléotida rata (ANI) ngagunakeun dRep (v.2.5.4).Ulangan)61 sareng 95% ambang ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) sareng gén pananda salinan tunggal nganggo SpecI63 nyayogikeun gugusan génom dina tingkat spésiés.Génom wawakil dipilih pikeun tiap kluster dRep dumasar kana skor kualitas maksimum (Q') anu didefinisikeun di luhur, anu dianggap wawakil spésiés.
Pikeun meunteun laju pemetaan, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) dianggo pikeun peta sadaya 1038 sét bacaan metagénomik sareng 34,799 génom anu aya dina OMD.Bacaan anu dikontrol ku kualitas dipetakeun dina modeu tunggal sareng alignments anu dihasilkeun disaring pikeun nahan ukur alignments ≥45 bp panjangna.jeung identitas ≥95%.Rasio tampilan pikeun tiap sampel nyaéta persentase bacaan anu sésana saatos filtrasi dibagi ku jumlah total bacaan kontrol kualitas.Ngagunakeun pendekatan anu sarua, unggal 1038 metagenom diréduksi jadi 5 juta inserts (data dimekarkeun, Gbr. 1c) sarta loyog jeung GORG SAG di OMD na di sakabéh GEM16.Jumlah MAGs pulih tina cai laut dina katalog GEM16 ditangtukeun ku kecap konci sumber metagénomik, milih sampel cai laut (contona, sabalikna tina sédimén laut).Sacara husus, urang milih "akuatik" salaku "ecosystem_category", "laut" salaku "ecosystem_type", sarta nyaring "habitat" salaku "laut jero", "laut", "samudera maritim", "laut pelagic", "cai laut" , "Samudra", "Cai Laut", "Cai Laut Permukaan", "Cai Laut Permukaan".Ieu ngakibatkeun 5903 MAG (734 kualitas luhur) disebarkeun leuwih 1823 OTUs (pintonan dieu).
Génom prokariot sacara taksonomi annotated maké GTDB-Tk (v.1.0.2)64 kalawan parameter standar nargétkeun GTDB r89 versi 13. Anvi'o dipaké pikeun ngaidentipikasi génom eukariot dumasar kana prediksi domain jeung recall ≥50% jeung redundansi ≤ 10%.Anotasi taksonomi hiji spésiés dihartikeun salaku salah sahiji génom wawakilna.Iwal eukariota (148 MAG), unggal génom munggaran dianotasi sacara fungsional ngagunakeun prokka (v.1.14.5)65, ngaran gen lengkep, nangtukeun parameter "archaea" atawa "baktéri" sakumaha diperlukeun, nu ogé dilaporkeun pikeun non- coding gén.jeung wewengkon CRISPR, diantara fitur génomik lianna.Annotate gén diprediksi ku identifying universal single-copy marker gén (uscMG) maké fetchMG (v.1.2)66, napelkeun grup ortholog na query maké emapper (v.2.0.1)67 dumasar kana eggNOG (v.5.0)68.Pangkalan data KEGG (diterbitkeun 10 Pebruari 2020) 69. Léngkah terakhir dilakukeun ku nyocogkeun protéin kana pangkalan data KEGG nganggo DIAMOND (v.0.9.30)70 kalayan kueri sareng cakupan topik ≥70%.Hasilna salajengna disaring nurutkeun NCBI Prokariot Genome Annotation Pipeline71 dumasar kana bitrate ≥ 50% tina maksimum ekspektasi bitrate (link sorangan).Runtuyan gén ogé dipaké salaku input pikeun ngaidentipikasi BGCs dina génom maké antiSMASH (v.5.1.0) 72 kalawan parameter standar sarta ledakan klaster béda.Sadaya génom sareng anotasi parantos disusun kana OMD sareng metadata kontekstual anu sayogi dina wéb (https://microbiomics.io/ocean/).
Sarupa jeung métode anu ditétélakeun saméméhna12,22 kami ngagunakeun CD-HIT (v.4.8.1) pikeun klaster> 56.6 juta protéin-coding gén tina génom baktéri jeung archaeal ti OMD kana 95% identitas jeung gén pondok (90% sinyalna) 73 nepi ka > 17,7 juta klaster gén.Runtuyan pangpanjangna dipilih minangka gén wawakil pikeun unggal klaster gén.Metagenom 1038 teras dicocogkeun sareng> 17.7 juta anggota kluster BWA (-a) sareng file BAM anu hasilna disaring pikeun nahan ngan ukur alignments kalayan identitas ≥95% sareng alignments dasar ≥45.Kelimpahan gén panjang-dinormalisasi diitung ku mimiti ngitung sisipan tina alignment unik pangalusna lajeng, pikeun sisipan Fuzzy-dipetakeun, nambahkeun cacah fractional kana gén target pakait sabanding jeung jumlah inserts unik maranéhanana.
Génom ti OMD dimekarkeun (kalawan MAGs tambahan tina "Ca. Eudormicrobiaceae ", tempo di handap) ditambahkeun kana mOTUs74 alat analisis metagénomic database (v.2.5.1) pikeun nyieun hiji database rujukan mOTU nambahan.Ngan genep génom salinan tunggal (23.528 génom) salamet tina sapuluh uscMGs.Perluasan database nyababkeun 4.494 klaster tambahan dina tingkat spésiés.1038 metagénomes dianalisis ngagunakeun parameter standar mOTU (v.2).Jumlahna aya 989 génom anu dikandung dina klaster 644 mOTU (95% REF, 5% SAG sareng 99.9% milik MarDB) henteu dideteksi ku profil mOTU.Ieu ngagambarkeun rupa-rupa sumber tambahan isolasi laut tina génom MarDB (lolobana génom undetected pakait sareng organisme diisolasi tina sédimén, sarwa laut, jsb).Pikeun neraskeun fokus kana lingkungan sagara kabuka dina ulikan ieu, urang ngaluarkeun aranjeunna tina analisa hilir iwal aranjeunna dideteksi atanapi kalebet kana pangkalan data mOTU ngalegaan anu diciptakeun dina ulikan ieu.
Kabéh BGCs ti MAG, SAG na REF di OMD (tempo di luhur) ieu digabungkeun jeung BGCs dicirikeun dina sakabéh scaffolds metagenomic (antiSMASH v.5.0, parameter standar) jeung dicirikeun ngagunakeun BiG-SLICE (v.1.1) (domain PFAM) 75.Dumasar fitur ieu, urang ngitung sakabéh jarak kosinus antara BGCs sarta dikelompokkeun aranjeunna (hartosna Tumbu) kana GCF na GCC maké thresholds jarak 0,2 jeung 0,8 mungguh.Ambang ieu mangrupikeun adaptasi ambang anu saacanna dianggo nganggo jarak Euclidean75 sareng jarak kosinus, anu ngirangan sababaraha kasalahan dina strategi clustering BiG-SLICE asli (Inpormasi Tambahan).
BGCs lajeng disaring pikeun nahan ukur ≥5 kb disandikeun dina scaffolds pikeun ngurangan résiko fragméntasi sakumaha ditétélakeun saméméhna16 sarta ngaluarkeun MarDB REFs na SAGs teu kapanggih dina 1038 metagénomes (tempo di luhur).Ieu nyababkeun jumlahna aya 39,055 BGC anu disandi ku génom OMD, kalayan tambahan 14,106 anu dicirikeun dina fragmen metagénomik (nyaéta henteu digabungkeun kana MAG).BGCs "metagénomik" ieu dianggo pikeun ngira-ngira proporsi poténsi biosintésis mikrobiom laut anu henteu kawengku dina pangkalan data (Émbaran Suplemén).Unggal BGC dicirian sacara fungsional dumasar kana jinis produk prediktif anu ditetepkeun ku kategori produk anti SMASH atanapi kasar anu ditetepkeun dina BiG-SCAPE76.Pikeun nyegah bias sampling dina kuantifikasi (komposisi taksonomi sareng fungsional GCC / GCF, jarak GCF sareng GCC ka pangkalan data rujukan, sareng kalimpahan metagénomik GCF), ku tetep ngan ukur BGC pangpanjangna per GCF pikeun unggal spésiés, 39,055 BGC di-deduplicated, dina hasilna total 17.689 BGC.
The novelty of GCC na GCF ieu ditaksir dumasar kana jarak antara database diitung (RefSeq database di BiG-FAM) 29 jeung eksperimen diverifikasi (MIBIG 2.0) 30 BGC.Pikeun unggal 17.689 BGC wawakil, urang milih jarak kosinus pangleutikna ka database masing-masing.Jarak minimum ieu lajeng rata-rata (rata-rata) nurutkeun GCF atanapi GCC, sakumaha luyu.A GCF dianggap anyar lamun jarak ka database leuwih gede ti 0,2, nu pakait jeung separation idéal antara (rata) GCF jeung rujukan.Pikeun GCC, urang milih 0,4, nu dua kali bangbarung ditetepkeun ku GCF, pikeun konci dina hubungan jangka panjang kalayan tumbu.
Kelimpahan metagénomik BGC diperkirakeun salaku rata-rata kelimpahan gén biosintétikna (sakumaha ditangtukeun ku anti-SMASH) anu sayogi tina profil tingkat gén.Kelimpahan metagénomik unggal GCF atanapi GCC teras diitung salaku jumlah perwakilan BGC (tina 17,689).Peta kaayaanana ieu salajengna dinormalisasi pikeun komposisi sélular ngagunakeun count mOTU per-sampel, nu ogé accounted usaha sequencing (data dimekarkeun, Gbr. 1d).Prévalénsi GCF atanapi GCC diitung salaku perséntase sampel kalayan kaayaanana > 0.
Jarak Euclidean antara sampel diitung tina profil GCF dinormalisasi.Jarak ieu dikirangan ukuranana nganggo UMAP77 sareng embeddings anu dihasilkeun dianggo pikeun kluster dumasar dénsitas anu teu diawaskeun nganggo HDBSCAN78.Jumlah minimum titik optimal pikeun klaster (jeung ku kituna jumlah klaster) dipaké ku HDBSCAN ditangtukeun ku maksimalkeun pungsi probabiliti kumulatif kaanggotaan klaster.Klaster anu diidentifikasi (sareng subsample saimbang acak tina klaster ieu pikeun ngitung bias dina analisis multivariate permutational of variance (PERMANOVA)) diuji pikeun significance ngalawan jarak Euclidean unreduced maké PERMANOVA.Rata-rata ukuran génom tina sampel diitung dumasar kana kaayaanana relatif mOTU jeung estimasi ukuran génom tina anggota génom.Khususna, ukuran génom rata-rata unggal mOTU diperkirakeun salaku rata-rata ukuran génom anggotana dilereskeun pikeun lengkep (sanggeus nyaring) (contona, génom lengkep 75% kalayan panjang 3 Mb gaduh ukuran saluyukeun 4. Mb).pikeun génom sedeng kalayan integritas ≥70%.Rata-rata ukuran génom pikeun tiap sampel ieu lajeng diitung salaku jumlah ukuran génom mOTU weighted ku kaayaanana relatif.
Hiji set disaring tina BGCs génom-disandikeun dina OMD ditémbongkeun dina baktéri jeung archaeal GTDB tangkal (dina ≥5 kb frameworks, kaasup REF na SAG MarDB teu kapanggih dina 1038 metagénomes, tempo di luhur) jeung diprediksi kategori produk maranéhanana dumasar kana filogenetik. posisi génom (tingali luhureun).Urang mimiti ngurangan data dumasar spésiésna, ngagunakeun génom jeung paling BGCs dina spésiés éta salaku wawakil.Pikeun visualisasi, wawakil anu salajengna dibagi kana grup tangkal, jeung deui, pikeun tiap clade celled, génom ngandung jumlah pangbadagna BGCs dipilih salaku wawakil.Spésiés anu diperkaya BGC (sahenteuna hiji génom sareng> 15 BGC) dianalisis satuluyna ku ngitung Indéks Diversity Shannon pikeun jinis produk anu disandikeun dina BGC éta.Upami sadaya jinis produk anu diprediksi sami, hibrida kimiawi sareng BGC kompleks sanésna (sakumaha anu diprediksi ku anti-SMAH) dianggap kalebet jinis produk anu sami, henteu paduli urutanna dina klaster (misalna protéin-bakteriosin sareng fusi bacteriocin-proteoprotein. awak).hibrid).
Sésana DNA (diperkirakeun 6 ng) tina sampel Malaspina MP1648, pakait jeung sampel biologis SAMN05421555 tur cocog jeung Illumina SRR3962772 metagenomic read diatur pikeun maca pondok, diolah nurutkeun protokol sequencing PacBio kalawan input ultra-low ngagunakeun PacBio kit sampel SMRTlification gDNA. kit (100-980-000) sarta SMRTbell Express 2.0 template préparasi kit (100-938-900).Sakeudeung, sésa DNA dipotong, dilereskeun sareng dimurnikeun (manik ProNex) nganggo Covaris (g-TUBE, 52104).DNA dimurnikeun ieu lajeng subjected kana persiapan perpustakaan, amplifikasi, purifikasi (manik ProNex) jeung Pilihan ukuran (> 6 kb, Blue Pippin) saméméh hambalan purifikasi final (manik ProNex) jeung sequencing on platform Sequel II.
Rekonstruksi kahiji dua ca.Pikeun MAG Eremiobacterota, kami ngaidentipikasi genep ANI tambahan> 99% (ieu kalebet dina Gambar 3), anu mimitina disaring dumasar kana skor kontaminasi (engké diidentifikasi minangka duplikasi gen, tingali di handap).Urang kapanggih ogé baki dilabélan "Ca".Eremiobacterota" ti sagala rupa studi23 sarta dipaké babarengan jeung dalapan MAGs tina ulikan urang salaku rujukan pikeun metagénomic maca tina 633 eukariot enriched (> 0.8 µm) sampel ngagunakeun BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - a bandéra) pikeun downsampled. pemetaan (5 juta dibaca).Dumasar kana peta spésifik pengayaan (disaring ku 95% identitas alignment sareng sinyalna 80% dibaca), 10 metagénomes (jangkauan diperkirakeun ≥5 ×) dipilih pikeun rakitan sareng tambahan 49 metagénomes (jangkauan diperkirakeun ≥1 ×) pikeun korelasi eusi.Ngagunakeun parameter sarua sakumaha di luhur, sampel ieu binned sarta 10 tambahan 'Ca' ditambahkeun.MAG Eremiobacterota geus disimpen deui.16 MAG ieu (teu cacah dua geus aya dina database) mawa total jumlah génom dina OMD dimekarkeun jadi 34.815.MAGs ditugaskeun pangkat taksonomi dumasar kana kasaruaan génomik maranéhanana jeung posisi di GTDB.18 MAGs dicabut nganggo dRep kana 5 spésiés (ANI intraspésifik> 99%) sareng 3 genera (ANI intragenerik 85% dugi ka 94%) dina kulawarga anu sami79.Wawakil spésiés dipilih sacara manual dumasar kana integritas, kontaminasi, sareng N50.Nomenklatur anu disarankeun disayogikeun dina Émbaran Suplemén.
Assess integritas jeung kontaminasi 'Ca.MAG Eremiobacterota, kami ditaksir ayana uscMG, kitu ogé turunan- jeung domain-spésifik single-salinan gén pananda susunan dipaké ku CheckM na Anvi'o.Idéntifikasi 2 duplikat ti 40 uscMGs dikonfirmasi ku rekonstruksi filogenetik (tempo di handap) pikeun ngaluarkeun sagala kontaminasi poténsial (ieu pakait jeung 5% dumasar kana 40 gén pananda ieu).Hiji studi tambahan lima wawakil MAGs 'Ca.Tingkat kontaminasi anu rendah dina génom anu direkonstruksi ieu dikonfirmasi pikeun spésiés Eremiobacterota nganggo antarmuka Anvi'o interaktif dumasar kana kelimpahan sareng korélasi komposisi runtuyan (Émbaran Tambahan)59.
Pikeun analisis filogenomik, kami milih lima MAG wawakil "Ca".Eudormicrobiaceae", sadaya spésiés "Ca.Génom Eremiobacterota sareng anggota filum sanés (kalebet UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria sareng Planctomycetota) sayogi ti GTDB (r89)13.Sakabéh génom ieu annotated sakumaha ditétélakeun saméméhna keur ékstraksi gén spidol salinan tunggal jeung annotation BGC.Génom GTDB dilestarikan dumasar kana kriteria integritas sareng kontaminasi di luhur.Analisis filogenetik dilakukeun ngagunakeun alur kerja Anvi'o Phylogenetics59.tangkal ieu diwangun ngagunakeun IQTREE (v.2.0.3) (pilihan standar na -bb 1000) 80 on alignment 39 tandem protéin ribosom diidentipikasi ku Anvi'o (OTOT, v.3.8.1551)81.Jabatanna dikurangan.pikeun nutupan sahenteuna 50% genome82 sareng Planctomycecota dianggo salaku outgroup dumasar kana topologi tangkal GTDB.Hiji tangkal tina 40 uscMGs diwangun ngagunakeun parabot jeung parameter sarua.
Kami nganggo Traitar (v.1.1.2) kalayan parameter standar (fenotip, tina nukléotida)83 pikeun ngaduga sipat mikroba umum.Urang ngajajah gaya hirup predator poténsial dumasar kana indéks predatory saméméhna dimekarkeun 84 nu gumantung kana eusi gén protéin-coding dina génom.Husus, kami nganggo DIAMOND pikeun ngabandingkeun protéin dina génom ngalawan database OrthoMCL (v.4)85 ngagunakeun pilihan -leuwih-sensitip -id 25 -query-panutup 70 -subject-panutup 70 -top 20 AND cacah gén pakait jeung gén pananda pikeun prédator jeung non-prédator.Indéks nyaéta bédana antara jumlah tanda prédator sareng henteu prédator.Salaku kontrol tambahan, kami ogé nganalisis génom "Ca".Faktor Entotheonella TSY118 dumasar kana pakaitna jeung Ca.Eudoremicrobium (ukuran génom ageung sareng poténsi biosintétik).Salajengna, urang nguji poténsi Tumbu antara prédator jeung gén spidol non-prédator jeung poténsi biosintétik Ca.Eudormicrobiaceae" sareng mendakan yén henteu langkung ti hiji gén (tina jinis gén pananda naon waé, nyaéta gén predator/non-prédator) tumpang tindih sareng BGC, nunjukkeun yén BGC henteu ngabingungkeun sinyal predasi.annotation génomik tambahan tina réplika scrambled dipigawé maké TXSSCAN (v.1.0.2) pikeun husus nalungtik sistem sékrési, pili, sarta flagella86.
Lima wawakil 'Ca urang dipetakeun ku pemetaan 623 metatranscriptomes ti fraksi pengayaan prokariot jeung eukariot tina sagara Tara22,40,87 (maké BWA, v.0.7.17-r1188, -a bandéra).génom Eudormicrobiaceae.Berkas BAM diolah nganggo FeatureCounts (v.2.0.1)88 saatos 80% maca sinyalna sareng 95% panyaring identitas (kalayan pilihan featureCounts –primary -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Ngitung Jumlah sisipan per gén.Peta anu dihasilkeun dinormalisasi pikeun panjang gén sareng kalimpahan gén pananda mOTU (jumlah sisipan rata-rata panjang-dinormalisasi pikeun gén kalayan jumlah sisipan> 0) sareng log-transformasi kana 22.74 pikeun kéngingkeun éksprési relatif per sél unggal tingkat gén, anu ogé ngajelaskeun variabilitas ti sampel ka sampel salila sequencing.Babandingan sapertos ngamungkinkeun analisa komparatif, ngirangan masalah komposisi nalika ngagunakeun data kalimpahan relatif.Ngan sampel kalawan> 5 tina 10 gén pananda mOTU dianggap pikeun analisis salajengna pikeun ngidinan porsi cukup badag tina génom bisa dideteksi.
Profil transkriptom dinormalisasi 'Ca.E. taraoceanii ieu subjected mun réduksi dimensionity maké UMAP sarta ngagambarkeun hasilna dipaké pikeun clustering unsupervised maké HDBSCAN (tingali luhureun) pikeun nangtukeun status ekspresi.PERMANOVA nguji significance tina béda antara klaster dicirikeun dina spasi jarak aslina (teu ngurangan).Ekspresi diferensial antara kaayaan ieu diuji di sakuliah génom (tingali di luhur) sareng 201 jalur KEGG diidentifikasi dina 6 gugus fungsi, nyaéta: BGC, sistem sékrési sareng gen flagellar ti TXSSCAN, énzim degradasi (protease sareng peptidase), sareng predator sareng non- gén predator.spidol indéks predatory.Pikeun unggal sampel, urang ngitung ekspresi normalisasi median pikeun tiap kelas (perhatikeun yén éksprési BGC sorangan diitung salaku ekspresi median gén biosintétik pikeun BGC éta) sareng diuji pikeun significance sakuliah nagara (test Kruskal-Wallis disaluyukeun pikeun FDR).
Gén sintétik dibeuli ti GenScript jeung PCR primers dibeuli ti Microsynth.Phusion polimérase ti Thermo Fisher Scientific dipaké pikeun amplifikasi DNA.Plasmid NucleoSpin, gél NucleoSpin sareng kit purifikasi PCR ti Macherey-Nagel digunakeun pikeun purifikasi DNA.Énzim pangwatesan sareng ligase DNA T4 dibeuli ti New England Biolabs.Kimia lian ti isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) jeung 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) dibeuli ti Sigma-Aldrich sarta dipaké tanpa purifikasi salajengna.Antibiotik chloramphenicol (Cm), spectinomycin dihydrochloride (Sm), ampicillin (Amp), gentamicin (Gt), jeung carbenicillin (Cbn) dibeuli ti AppliChem.Komponén média Bacto Tryptone sareng Bacto Yeast Extract dibeuli ti BD Biosciences.Trypsin pikeun sequencing dibeuli ti Promega.
Runtuyan gén anu sasari tina anti SMASH diprediksi BGC 75.1.E. malaspinii (Émbaran tambahan).
Gén embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), sareng embAM (kaasup wilayah intergene) diurutkeun salaku konstruk pdonuc57 sareng A (dioptimalkeun salaku konstruk sintétik dina EmpR57) iraha.Gén embA disubklonkeun kana sababaraha situs kloning munggaran (MCS1) tina pACYCDuet-1 (CmR) sareng pCDFDuet-1 (SmR) sareng situs pembelahan BamHI sareng HindIII.Gén embM sareng embMopt (kodon-dioptimalkeun) disubklonkeun kana MCS1 pCDFDuet-1(SmR) sareng BamHI sareng HindIII sareng disimpen dina sababaraha situs kloning kadua pCDFDuet-1 (SmR) sareng pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) kalayan NdeI/ChoI.Kaset embAM disubklonkeun kana pCDFDuet1(SmR) sareng situs belahan BamHI sareng HindIII.Gén orf3/embI (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) diwangun ku PCR extension tumpang tindih ngagunakeun primers EmbI_OE_F_NdeI jeung EmbI_OE_R_XhoI, dicerna jeung NdeI/XhoI-FDU énzim (réménsi NdeI/XhoIFD, sarta ligated MMC-1 sarua) Suplemén méja).6).Nyerna sareng ligasi énzim pangwatesan dilaksanakeun dumasar kana protokol produsén (New England Biolabs).